ают процент
диссоциации по формуле:

 

                     количество измененных

                           колоний

     % диссоциации = —————————————————————— х
100%

                        общее количество

                      просмотренных колоний

 

Если процент диссоциированных
колоний более 25%, то данная культура не пригодна для дальнейшего
использования.

1.5.2. Контроль видовых
свойств Е. coli М17-02 и Е. соli К12 F(+) Str(R)

После восстановления
лиофилизированной культуры проводится типирование культуры по биохимическим
свойствам до вида.

Идентификацию рекомендуется
проводить с использованием тест-систем биохимической идентификации семейства
Enterobacteriaceae, разрешенных к применению. При этом следует
руководствоваться рекомендациями производителя. Правомочна постановка отдельных
биохимических тестов.

Перед очередным
ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры оценку эталонного штамма Е.
coli проводят путем подтверждения следующих основных свойств:

- отсутствие оксидазной
активности;

- грам-негативности;

- способности образовывать на
среде Эндо характерные темно-красные (малиновые) колонии с металлическим
блеском и отпечатком на среде;

- способности утилизировать
лактозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч и 44°С в течение
24 ч;

- способности утилизировать
глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24 ч.

Если культура не
соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего
использования.

1.5.3. Проверка
чувствительности Е. соli К12 F(+) Str(R)

Способность Е. coli К12 F(+)
Str(R) лизироваться специфичным фагом, является основополагающим свойством
тест-культуры, на котором основан метод определения колифагов в воде.

Проверка чувствительности
осуществляется каждый раз, когда из запасов хранения берется новая пробирка с
рабочей культурой, хранящейся на полужидком агаре.

Выполнение анализа

Бактериальную взвесь готовят
по п.8.5.2.3. На 100 мл расплавленного и остуженного до (45 - 49)°С
питательного агара вносят 1 мл бактериальной взвеси и разливают в чашки. После
застывания чашки на поверхность агара наносят каплю (0,05 мл) суспензии фага,
не захватывая хлороформа. Инкубируют в течение 18 - 24 ч при 37°С. Просмотр
посевов следует осуществлять в проходящем свете.

Культура считается
восприимчивой и пригодной для проведения анализов воды при наличии четких зон
лизиса. При отсутствии зон лизиса культура не пригодна для использования и
подлежит замене.

1.5.4. Проверка культуры Е.
coli К12 F(+) Str(R) на загрязненность фагом

Бактериальную взвесь готовят
по п.8.5.2.3, вносят в расплавленный и остуженный до температуры (45 - 49)°С
питательный агар из расчета 1 мл взвеси на 100 мл агара. Чашку Петри заливают
приготовленной смесью, инкубируют при температуре 37°С 18 - 24 ч.

Просмотр посевов осуществляют
в проходящем свете. Культура должна давать равномерный газон роста. Наличие зон
лизиса в контроле свидетельствует о загрязненности культуры фагами.

1.5.5. Контроль видовых
свойств Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens

Оценку эталонного штамма
Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens проводят путем подтверждения
следующих свойств:

- наличия оксидазной
активности;

- грам-негативности;

- роста на ПБ в виде
серебристой пленки на поверхности с образованием кольца сине-зеленого пигмента;

- наличия сине-зеленого
пигмента пиоцианина при росте на ПА при 37 С;

- способности роста на
питательном агаре при 42°С в течение 24 ч (для Pseudomonas aeruginosa);

- способности роста на питательном
агаре при 4°С в течение 24 ч (для Pseudomonas fluorescens).

Если культура не
соответствует видовым свойствам, то она не пригодна для дальнейшего
использования.

 

2.
Культивирование, хранение и контроль эталонных культур бактериофагов

 

В качестве эталонного штамма
для проведения контроля культуры клеток-хозяина при проведении анализа на
колифаги используется РНК-содержащий фаг MS2.

Процесс ведения эталонного
штамма колифага MS2 состоит из 2 функциональных блоков:

- восстановление лиофилизированной
культуры;

- создание запасов эталонной
культуры и культур для целевого использования.

2.1. Восстановление
лиофилизированной культуры

Оттянутый конец ампулы с
лиофилизированными культурами нагревают над пламенем горелки. Влажным концом
стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего
появляются трещины.

Конец ампулы накрывают
трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70-ным этиловым спиртом и хорошо
отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается
накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают
и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу вносят
приблизительно 0,5 мл питательного бульона для регидратации.

2.2. Создание запасов
эталонных культур фага и культур для целевого использования

Рабочую культуру Е. coli К12
F(+) Str(R), хранящуюся на полужидком агаре, засевают в пробирку с 10 мл
питательного бульона. Посевы инкубируют при (37±1)°С 18 - 24 ч.

После инкубации 0,1 мл
полученной бульонной культуры повторно засевают в 3 - 4 пробирки с 10 мл
питательного бульона и помещают в термостат при (37±1)°С. Через 2 ч инкубации в
каждую пробирку вносят регидрированную культуру фага MS_2, инкубацию продолжают
до 18 - 24 ч. После инкубации в пробирку добавляют по 1 мл хлороформа,
герметично укупоривают, интенсивно встряхивают и оставляют на ночь в
холодильнике.

Пипеткой отбирают бульон над
осевшим хлороформом и переносят в стерильные пробирки, добавляют по 1 мл
хлороформа, герметично укупоривают, встряхивают и хранят в холодильнике.

Одну пробирку используют для
целевого назначения в контроле чувствительности культуры Е. coli К12 F(+)
Str(R) к фагу. Две других служат запасом эталонного фага.

Активность полученной
культуры определяется титром фага. Для использования допускается культура с
титром более 10(7) - 10(8). Через год хранения титр фага может снизиться. В
этой связи необходимо получить новую культуру или провести определение титра
хранящегося фага.

2.3. Определение титра фага

Для определения титра фага выполняется
серия десятикратных разведений культуры фага (п.2.2). По 1 мл каждого
разведения вносят в чашки Петри и заливают смесью питательного агара и Е. coli
К12 F(+) Str(К), приготовленной аналогично описанному в п.1.5.4 прилож.2.
Посевы инкубируют при (37±1)°С. Пробирки с разведениями закупоривают резиновыми
или силиконовыми пробками и хранят до получения результатов при температуре
(4±2)°С для приготовления рабочих суспензий фага.

Через 18 - 24 ч инкубации
просчитывают количество бляшек на чашках. Учету подлежат чашки, на которых
отмечается рост 30 - 100 негативных колоний фага.

При получении титра менее
10(7) фаг можно размножить. Для нарастания титра необходимо повторить описанную
процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов
необходимо провести тщательную обработку помещения дезсредствами и
обеззараживание ультрафиолетовым облучением.