-     
|     -     |

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


 

______________________________

* Вероятность ниже
допустимого уровня. Количественный учет невозможен, результат оценивается
качественно.

 

Таблица 1.2

"Расчет
наиболее вероятного числа (НВЧ) колифагов в 100 мл.

Наиболее
вероятное число (НВЧ) в 100 мл"

 

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


|   Число положительных    |НВЧ в 100 |Вероятность|  Нижний 
| Верхний  |

|       результатов        |    мл    |           |  предел  | 
предел  |

|——————————————————————————|          |           |          |          |

|из 1 объема |из 5
объемов |          |           |          |          |

|  по 50 мл 
|  по 10 мл   |         
|           |          |          |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     1     
|      4      |  
16,1   |  0,4095  
|   1,9    |  113,9   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     1     
|      3      |  
9,3    |  0,3422  
|   1,1    |   77,4   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     1     
|      2      |  
5,6    |  0,3218  
|   0,7    |   46,4   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     1     
|      1      |  
3,2    |  0,3039  
|   0,4    |   26,2   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     1     
|      0      |  
1,4    |  0,2500  
|   0,2    |   11,5   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     0     
|      5      |  
6,9    |  0,0010  
|   0,8    |   57,6   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     0     
|      4      |  
5,1    |  0,0060  
|   0,6    |   42,5   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     0     
|      3      |  
3,6    |  0,0222  
|   0,4    |   29,6   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     0     
|      2      |  
2,2    |  0,0671  
|   0,3    |   18,5   |

|————————————|—————————————|——————————|———————————|——————————|——————————|

|     0     
|      1      |  
1,1    |  0,1937  
|   0,1    |   8,8    |

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————







 

Приложение
2

(обязательное)

Ведение
эталонных культур

 

Ведение эталонных культур
обеспечивает максимальное сохранение типовых свойств штаммов, что достигается
соблюдением принципов их культивирования, контроля и хранения.

Согласно санитарным правилам
СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования
микроорганизмов III - IV групп патогенности", п.3.1.6
"Производственным предприятиям, контролирующим готовую продукцию,
разрешается иметь только коллекцию типовых культур, предусмотренных
нормативно-технической документацией".

Хранение культур
осуществляется в соответствии с п.3.2.12 СП 1.2.036-95. Лаборатория должна
иметь разрешение на работу с микроорганизмами III - IV групп патогенности.

 

1. Ведение
бактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов

 

Основные
положения

 

В качестве контрольных
тест-штаммов используют эталонные культуры, полученные из официально признанной
коллекции микроорганизмов (п.4.5).

Хранение запасов рабочей
культуры осуществляется в столбике полужидкого агара, срок хранения 3 мес.

Для целевого использования
пригодна суточная ("ночная") культура эталонного штамма, прошедшая не
более 2 пассажей на питательных средах, с момента высева со среды для хранения
запасов рабочей культуры.

Восполнение запасов рабочей
культуры допускается не более трех раз. В этой связи срок использования
эталонной культуры с момента вскрытия ампулы - 1 год.

На этапах восстановления из
лиофилизированного состояния и восполнения запасов рабочих культур
осуществляется контроль сохранения видовых и паспортных свойств тест-культуры.

Культура с измененными
свойствами в анализе не используется.

По истечении года необходимо
получить новую лиофилизированную эталонную культуру из коллекции
микроорганизмов.

Процедура ведения культуры
включает следующие этапы:

- восстановление
лиофилизированной культуры;

- создание и хранение запасов
рабочей культуры;

- восполнение запасов рабочей
культуры;

- подготовка культуры для
целевого использования в анализе;

- контроль видовых и
паспортных свойств.

1.1. Восстановление
лиофилизированной эталонной культуры

Оттянутый конец ампулы с
лиофилизированной культурой нагревают над пламенем горелки. Влажным концом
стерильного ватного тампона прикасаются к нагретой части, в результате чего
появляются трещины. Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной
70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула
остается накрытой той же салфеткой в течение 1 - 2 мин. Затем салфетку
осторожно снимают и вместе с остатками стекла погружают в дезраствор. В ампулу
вносят приблизительно 0,5 мл питательного бульона (п.5.2.1) для регидратации.
Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской пипеткой или
шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при (37±1)°С в течение
18 - 24 ч.

После инкубации из питательного
бульона делают высев петлей на скошенный питательный агар в две пробирки
(п.5.3.1).

При восстановлении штамма E.
coli K12F(+) Str(R) посев осуществляется на скошенный питательный агар,
содержащий стрептомицин (п.5.3.5).

Посевы инкубируют при 37°С в
течение 18-24 ч.

Одну пробирку с посевом
используют для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым,
паспортным свойствам (п.п.1.5.2 - 1.5.5 прилож.2).

Второй посев на скошенном
питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры (п.1.2
прилож.2).

Оставшуюся бульонную культуру
Е. coli M17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как
это описано в пункте 1.5.1 приложения 2.

При несоответствии штамма
видовым и паспортным свойствам и (или) при наличии более 25% полиморфных
(нетипичных) колоний в R-форме полученную культуру для работы не используют.

1.2. Создание запасов рабочей
культуры

При удовлетворительном
прохождении контрольных тестов (п.п.1.5.1 - 1.5.5 прилож.2) культуру со
скошенного питательного агара (для E.coli K12F(+) Str(R) - с питательного агара
со стрептомицином) засевают уколом в столбик с полужидким агаром (п.5.3.4). В
зависимости от интенсивности работы лаборатории посев проводят в 4 - 10
пробирок, из расчета по 1 - 3 пробирки на 1 мес. работы и 1 пробирки для
восполнения запасов рабочей культуры через 3 мес. на следующий квартал (п.1.3
прилож.2).

Посевы инкубируют 18 - 24 ч
при 37°С. При наличии роста пробирки закрывают резиновыми (силиконовыми)
пробками и закладывают на хранение при температуре (4 - 8)°С.

Одну из пробирок с культурой,
предназначенной для восполнения рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно.
Запасы рабочей культуры желательно хранить в отдельном холодильнике.

1.3. Восполнение запасов
рабочей культуры

Восполнение запасов рабочей
культуры производится в конце третьего, шестого и девятого месяца с момента
вскрытия ампулы (каждые 3 мес.).

Для восполнения запасов
рабочей культуры используется субкультура на среде хранения, полученная ранее
при создании запасов или при очередном их восполнении.

Из пробирки с культурой,
предназначенной для восполнения запасов, производят посев в питательный бульон.
Посевы инкубируют при 37°С 18 - 24 ч.

После инкубации из
питательного бульона делают высев петлей в две пробирки со скошенным
питательным агаром (п.5.3.1). При ведении штамма E.coli К12 F(+) Str(R) посев
осуществляется на скошенный питательный агар, содержащий стрептомицин (5.3.5).
Посевы инкубируют при 37°С (18±2) ч.

Один из посевов используют
для постановки тестов на соответствие полученного штамма видовым, паспортным
свойствам (п.п.1.5.2 - 1.5.5 прилож.2).

Второй посев на скошенном
питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры (п.1.2
прилож.2).

Оставшуюся бульонную культуру
E.coli М17-02 используют для оценки степени диссоциации эталонного штамма, как
это описано в п.1.5.1 прилож.2.

При наличии более 25%
полиморфных (нетипичных) колоний и (или) при несоответствии штамма видовым и
паспортным свойствам полученную культуру для дальнейшей работы не используют.

Необходимо получить новую
ампулу с эталонной культурой и начать процедуру ведения тестового штамма
сначала.

При удовлетворительном
прохождении контрольных тестов процедура закладки культуры на хранение
осуществляется согласно п.1.2 прилож.2.

Восполнение запасов рабочей
культуры проводят только три раза.

По истечении года
использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции
микроорганизмов.

1.4. Подготовка культуры для
целевого использования в анализе

Накануне использования
культуру с полужидкого агара высевают на 2 пробирки со скошенным питательным
агаром (п.5.3.1). Для культуры Е. coli К12 F(+) Str(R) используют питательный
агар со стрептомицином (п.5.3.5). Посев инкубируют 18 - 24 ч при 37°С.

Культуру из одной пробирки
используют по назначению. Вторая пробирка с культурой на скошенном питательном
агаре используется для получения культуры для работы на следующий (второй)
день.

При необходимости получения
культуры тест-штамма на третий день высев снова производят с полужидкого агара.

7.5. Контроль эталонных
бактериальных культур

Постановка контроля включает:

- оценку степени диссоциации
культуры Е. coli М17-02;

- проверку видовых свойств
бактериальных культур;

- проверку способности Е.
coli К12 F(+) Str(R) проверку культуры Е. coli К12 F(+) Str(R) на однородность
и отсутствие загрязнения фагом.

1.5.1. Оценка степени
диссоциации культуры Е. coli М17-02

Из 18-часовой бульонной
культуры делают 10-кратные разведения физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5
и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного агара предварительно
подсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по поверхности агара по
полного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при температуре (37±1)°С в
течение 18 - 24 ч.

Выбирают чашки, на которых
выросло от 30 до 100 колоний.

Проверку тест-штаммов на
диссоциацию производят путем визуального просмотра изолированных колоний на чашках
в прямом и косонаправленном свете через бинокулярную лупу или микроскоп на
малом увеличении.

На питательном агаре бактерии
вида Е. coli образуют колонии средней величины 3 - 5 мм, плоско-выпуклые,
круглые, гладкие с ровным краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в
прямом и непрозрачные (опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем
свете колонии эшерихий могут иметь равномерную зернистость.

В R-форме колонии эшерихий
более плоские, большего размера, неправильной формы с неровными краями и
шероховатой, матовой поверхностью.

При наличии диссоциации (по
размеру, S-R-диссоциация, др.) подсчитывают количество измененных колоний и
общее количество просмотренных колоний.

Общее количество
просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем рассчитыв