в 100 мл

     (40 + 100)

 

8.2.4.4. Если при выборочной
проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют
числа ОКБ или ТКБ среди колоний этого типа по формуле:

 

          (a x c)

     X = —————————,

             b

 

  где: 
Х - число подтвержденных бактерий одного типа;

        а - общее число колоний этого типа;

        b - число проверенных из них;

        с - число колоний с положительным
результатом.

 

Полученные результаты учета
по каждому типу колоний суммируют и далее подсчитывают по п.8.2.4.3 - 8.2.4.4.

8.2.4.5. Окончательный
результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 мл, из них количество КОЕ ТКБ в 100
мл.

Ориентировочный результат
может быть выдан при обнаружении типичных колиформных колоний на среде Эндо,
образованных грамотрицательными оксидазоотрицательными бактериями.
Окончательный ответ подтверждается по результатам ферментации лактозы.

8.2.4.6. При наложении
колоний или сплошном росте на всех фильтрах (п.8.2.3.5) в случае подтверждения
принадлежности к ОКБ и ТКБ выдается качественный результат "обнаружено ОКБ
в 100 мл".

Если все колонии на фильтре
оксидазоположительные или не подтвердилась их принадлежность к ОКБ и ТКБ,
анализ завершается, в протоколе отмечают "зарост фильтров".

В обоих случаях анализ
повторяют.

 

8.3.
Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

 

8.3.1. Определение понятия
показателя

Определение понятия
показателей ОКБ и ТКБ по п.8.2.1.

8.3.2. Область применения

Титрационный метод может быть
использован:

- при отсутствии материалов и
оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;

- при анализе воды с большим
содержанием взвешенных веществ;

- в случае преобладания в
воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных
колоний общих колиформных бактерий.

8.3.3. Принцип метода

Метод основан на накоплении
бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с
последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой
и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

8.3.4. Выполнение анализа

При исследовании питьевой
воды качественным методом (текущий санэпиднадзор, производственный контроль)
засевают 3 объема по 100 мл.

При исследованиях воды с
целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят
посев: 3 объемов по 100 мл, 3 объемов по 10 мл, 3 объемов по 1 мл.

Каждый объем исследуемой воды
засевают в лактозо-пептонную среду, приготовленную по п.5.5. Посев 100 мл и 10
мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев
1 мл пробы проводят в 10 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при
(37±1)°С в течение 48 ч. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную
оценку посевов. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и
образование газа, производят высев бактериологической петлей на сектора среды
Эндо (п.5.4.1) для получения изолированных колоний.

Емкости без наличия роста и
образования газа оставляют в термостате и окончательно просматривают через 48
ч. Посевы без признаков роста считают отрицательными и дальнейшему исследованию
они не подлежат. Из емкостей, где отмечено помутнение и образование газа или
только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо
инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 18 - 20 ч.

При образовании помутнения и
газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для
лактозоположительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим
блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной
среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в
данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется
подтвердить:

- если в среде накопления
отмечено только помутнение;

- если принадлежность к
лактозоположительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

В этих случаях:

- проверяют наличие отпечатка
на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии;

- выполняют оксидазный тест
по п.8.2.3.2;

- подтверждают принадлежность
к Граму по п.8.2.3.3;

- подтверждают способность к
газообразованию при посеве изолированных 1 - 2 колоний каждого типа с каждого
сектора на среду с лактозой по п.5.6 с последующей инкубацией посевов при
температуре (37±1)°С в течение 24 - 48 ч.

При отсутствии изолированных
колоний проводят рассев на среду Эндо общепринятыми бактериологическими
методами.

Отрицательный ответ дают,
если:

- в среде накопления нет
признаков роста;

- на секторах среды Эндо нет
роста;

- на секторах среды Эндо
выросли не характерные для колиформных бактерий колонии (прозрачные с неровными
краями, расплывчатые и т.п.);

- все колонии оказались
оксидазоположительными;

- все колонии оказались
грамположительными;

- если в подтверждающем тесте
на среде с углеводом не отмечено газообразования.

Для определения
термотолерантных колиформных бактерий работают с секторами среды Эндо, где
выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2 - 3 изолированных
колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с любой из лактозных сред,
приготовленных по п.5.6.

Среду перед посевом нагревают
на водяной бане или в термостате до 44°С. Немедленно после посева пробирки
помещают в термостат и инкубируют при температуре (44±0,5)°С в течение 24 ч.
Допускается просмотр посевов через 4 - 6 ч.

При образовании газа в среде
накопления, росте на среде Эндо лактозоположительных бактерий и выявлении
способности этих бактерий ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24
ч при температуре 44°С дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы
воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допустимо для ускорения
выдачи ответа на присутствие ТКБ производить высев 1 мл из объемов среды
накопления, где отмечено помутнение и газообразование в пробирке с
лактозо-пептонной средой с поплавком по п.5.6 и прогретой предварительно до
температуры 44°С. Посевы выдерживают в термостате при температуре (44±0,5)°С в
течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

8.3.5. Учет результатов

При исследовании 3 объемов по
100 мл результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в
одном из 3 объемов, делается запись в протоколе "обнаружены в 100
мл".

При исследовании
количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по
табл.1.1 прилож.1.

Результат сообщают без
доверительного интервала.

При отрицательном ответе на
наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе
"не обнаружены в 100 мл".

 

8.4.
Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

 

8.4.1. Определение понятия
показателя

Сульфитредуцирующие
клостридии - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы,
редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при температуре (44±1)°С
в течение 16 - 18 ч.

8.4.2. Принцип метода

Метод основан на выращивании
посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным, и
подсчете числа черных колоний.

8.4.3. Выполнение анализа

8.4.3.1. Пробу воды 20 мл
прогревают на водяной бане в пробирках при температуре (75±5)°С в течение 15
мин для исключения вегетативных форм.

При исследовании
хлорированной воды прогревание пробы можно не производить.

Из каждой пробы питьевой воды
делают посев или фильтруют 20 мл. При необходимости подбирают объемы с таким
расчетом, чтобы в посевах (на фильтpax) выросло не более 10 - 15 колоний. При
этом ориентируются на результаты предыдущих исследований.

Фильтрование воды производят
в соответствии с требованиями, изложенными в п.7.

8.4.3.2. Определение методом
фильтрования в пробирках

Перед посевом пробирки с
железосульфитным агаром, приготовленным по 5.8. расплавляют на водяной бане (не
кипятить!). В течение посева поддерживают среду нагретой до (70 - 80)°С в
водяной бане.

После фильтрования
установленного объема воды мембранный фильтр фламбированным пинцетом берут за
два противоположных края и согнутый в виде трубочки помещают в пробирку с
горячим агаром. Сторона фильтра с осевшими бактериями обращена внутрь. При этом
фильтр распрямляется и располагается по стенке пробирки.

Сразу же после посева
пробирку с агаром и фильтром для создания анаэробных условий быстро охлаждают,
помещая в емкость с холодной водой. Культивируют посевы при (44±1)°С в течение
16 - 18 ч.

8.4.3.3. Определение методом
фильтрования в чашках Петри

Чашки Петри диаметром 55 - 60
мм заливают тонким слоем железосульфитного агара. После фильтрации фильтр
поместить фильтрующей поверхностью вниз на застывшую питательную среду так,
чтобы под фильтром не было пузырьков воздуха. Затем заливают расплавленным
железосульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к
среде для создания анаэробных условий. Культивируют посевы при (44±1)°С в
течение 16 - 18 ч.

8.4.3.4. Определение прямым
посевом

Железосульфитный агар во
флаконах и пробу воды готовят, как это описано в п.8.4.3.1.

В стерильные пробирки вносят:

- по 10 мл в 2 пробирки
(объемом не менее 30 мл) или

- по 5 мл в 4 пробирки
(объемом по 15 мл).

Посевы заливают горячим
железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду
заливать по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого
пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания
анаэробных условий. Посевы инкубируют при (44±1)°С в течение 16 - 18 ч.

8.4.4. Учет результатов

Количественному учету
подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают
черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды.

Результат анализа выражают
числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20
мл воды.

При отсутствии роста черных
колоний на всех фильтрах дают ответ "не обнаружено в 20 мл воды".

При невозможности учета
колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в
протоколе отмечают "обнаружено в 20 мл". При необходимости получения
количественного результата анализ повторяют.

 

8.5.
Определение колифагов

 

8.5.1. Определение понятия
показателя

Колифаги - бактериальные
вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре (37±1)°С
через (18±2) ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.

8.5.2. Титрационный метод
определения колифагов

8.5.2.1. Принцип метода

Определение колифагов в
питьевой воде заключается в предварительном накоплении колифагов в среде
обогащения на культуре Е. coli и последующем выявлении зон лизиса
(просветления) газона Е. coli на питательном агаре.

8.5.2.2. Область применения

Метод предназначен для
проведения текущего контроля качества питьевой воды.

8.5.2.3. Подготовка
тест-культуры Е. coli К12 Str(R).

На всех этапах исследования
используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру Е.
coli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром со стрептомицином
(п.5.3.5). Через (18±2) ч инкубации при температуре (37±1)°С произвести смыв
бактерий с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора (0,85%-ный раствор
NaCl) и по стандарту мутности готовят взвесь Е. coli в концентрации 10(9)
бактериальных клеток в 1 мл.

Допускается использование
4-часовой бульонной культуры Е. coli, полученной путем подращивания в
термостате при температуре 37°С. Концентрация 10(9) бактериальных клеток Е.
coli содержится в 2 мл.

8.5.2.4. Проведение
качественного анализа

В исследуемую пробу воды
объемом 100 мл вносят 10 мл 10-кратного питательного бульона (приготовленного
по п.5.2.2) и 1 мл подготовленного смыва тест-культуры или 2 мл 4-часовой
бульонной культуры (п.8.5.2.3).

Для контроля культуры 0,1 мл
смыва бактерий Е. coli (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) помещают в
чашку Петри и заливают питательным агаром.

Исследуемую пробу воды (100
мл) и чашку Петри с контролем Е. coli помещают в термостат и инкубируют при
температуре (37±1)°С в течение (18±2) ч.

После инкубации из
исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 мл и добавляют 1 мл хлороформа.

Пробирку закрыва