ированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают
его воронкой.

 

7.3.
Фильтрование воды

 

В воронку прибора для
фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум.

При посеве нескольких объемов
одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без
обеззараживания сначала меньшие, а затем большие объемы воды, меняя каждый раз
фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Следует начинать с
фильтрования проб обеззараженной воды или тех проб, которые предположительно не
загрязнены, а затем фильтровать загрязненные пробы.

При фильтровании 1 мл
исследуемой воды следует в воронку налить предварительно не менее 10 мл
стерильной воды, а затем внести анализируемую воду.

После окончания фильтрования
и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно
поднимают за край фламбированным пинцетом и переносят его, не переворачивая, на
питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между
средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть
обращена вверх.

Под каждым фильтром на дне
чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и
даты посева. На одну чашку можно поместить 3 - 4 фильтра с условием, чтобы
фильтры не соприкасались.

 

8.
Проведение анализа

 

8.1.
Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном
агаре

 

8.1.1. Определение понятия
показателя

Метод определяет в питьевой
воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных
микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном arape при
температуре 37°С в течение 24 ч, видимые с увеличением в 2 раза.

8.1.2. Выполнение анализа

Из каждой пробы делают посев
не менее двух объемов по 1 мл.

После тщательного
перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка
приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают 8 - 12 мл (на
чашку диаметром 90 - 100 мм) расплавленного и остуженного до (45 - 49)°С
питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится.
Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну,
избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки.
Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до
застывания агара.

Расплавленный агар на период
проведения анализа помещают в водяную баню или термостат, поддерживающие
температуру (45 - 49)°С.

После застывания агара чашки
с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре
(37±1)°С в течение (24±2) ч.

8.1.3. Учет результатов

Подсчитывают все выросшие на
чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки,
на которых выросло не более 300 изолированных колоний.

Количество колоний на обеих
чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих
единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды.

Если на одной из 2 чашек
подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке.
Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не
распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и
анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на
всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают "число КОЕ/ мл -
ориентировочно".

Если подсчет колоний на
чашках невозможен, то в протоколе отмечают "сплошной рост".

 

8.2.
Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной
фильтрации (основной метод)

 

8.2.1. Определение понятия
показателя

Общие колиформные бактерии
(ОКБ) - грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки,
способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до
кислоты, альдегида и газа при температуре (37±1)°С в течение 24 - 48 ч.

Термотолерантные колиформные
бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их
признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида
и газа при температуре (44±0,5)°С в течение 24 ч.

8.2.2. Принцип метода

Метод основан на фильтрации
установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на
дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации
колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

8.2.3. Выполнение анализа

8.2.3.1. Порядок исследования

При исследовании питьевой
воды анализируют 3 объема по 100 мл.

При получении стабильных
отрицательных результатов допустима фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

При фильтрации воды
неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов
для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 мл
воды).

Отмеренный объем воды
фильтруют через мембранные фильтры с соблюдением требований, изложенных в п.7.

Фильтры помещают на среду
Эндо, приготовленную по п.5.4. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх
и инкубируют посевы при температуре (37±1)°С в течение (24±2) ч.

Если на фильтрах нет роста
или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые,
выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды.
Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен
рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных,
красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний
с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого
типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Для подтверждения наличия ОКБ
исследуют:

- все колонии, если на
фильтрах выросло менее 5 колоний;

- не менее 3 - 4 колоний
каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ
исследуют все типичные колонии, но не более 10.

Каждую выбранную
изолированную колонию исследуют на:

- наличие оксидазной
активности;

принадлежность к Граму
(микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);

- ферментацию лактозы до
кислоты и газа.

8.2.3.2. Постановка
оксидазного теста

Полоску фильтровальной бумаги
помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2 - 3 каплями реактива для
оксидазного теста по п.5.7. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной
водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей (металлическая
петля из нихрома может дать ложноположительную реакцию) наносят штрихом на
подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в
течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое (п.5.7.1 вариант 1) или синее
(п.5.7.2 вариант 2 и СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной
реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном
результате эту колонию из дальнейшего исследования исключают.

Если при исследовании
колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий
результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар.
После инкубации тест повторяют.

8.2.3.3. Определение
принадлежности к Граму

Из оксидазоотрицательной
колонии делается мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется.

На обезжиренное спиртом
предметное стекло наносят петлей 1 каплю дистиллированной воды, вносят
небольшое количество культуры из анализируемой колонии и распределяют по
поверхности стекла. Мазок высушивают при комнатной температуре и фиксируют
трехкратным проведением через пламя горелки. На препарат накладывают полоску
фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый раствор генциана фиолетового
на 0,5 - 1 мин, снимают бумагу, наливают раствор Люголя на 0,5 - 1 мин, сливают
раствор Люголя и стекло промывают в этиловом спирте в течение 0,5 - 1 мин, пока
не перестанет отходить краситель. Затем стекло тщательно промывают водой и
докрашивают в течение 1 - 2 мин фуксином Циля, разведенным 1:10
дистиллированной водой. После промывания и просушивания препарата мазок
микроскопируют.

Приготовление реактивов для
окраски по Граму изложено в п.5.9.

Грамотрицательные
микроорганизмы имеют розовую окраску, грамположительные окрашиваются в синий
цвет. Колиформные бактерии являются грамотрицательными палочками.

Окраска по Граму может быть
заменена тестом Грегерсена, не требующим использования оптики.

Тест Грегерсена: в капле
3%-ного водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную
массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь
ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность
испытуемой культуры или колонии к грамотрицательному виду. У грамположительных
бактерий слизистые нити не образуются - реакция отрицательная.

8.2.3.4. Определение
ферментации лактозы

Оставшуюся часть
оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают
параллельно в две пробирки с лактозной средой (п.5.6):

- для подтверждения наличия
ОКБ посев инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 48 ч;

- для подтверждения наличия
ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до температуры (43 -
44)°С, и инкубируют при температуре (44±0,5)°С в
течение 24 ч.

Первичный учет образования
кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах и СИБ (п.5.6) возможен через
4 - 6 ч. При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ. При
отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с посевами
для окончательного учета ТКБ оставляют до 24 ч. Пробирки с посевами для
подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного
результата оставляют для окончательного учета до 48 ч.

Если колония, подлежащая
исследованию, незначительных размеров, ее пересевают на скошенный питательный
агар и после инкубации в течение 18 - 24 ч выполняют все необходимые
подтверждающие тесты.

8.2.3.5. Постановка
подтверждающих тестов при наложении колоний или сплошном росте

Если на части или на всей
поверхности фильтра наблюдается наложение колоний или сплошной рост, выполняют
оксидазный тест путем помещения мембранного фильтра на кружок фильтровальной
бумаги большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивом, или на диск
СИБ-оксидаза, смоченный дистиллированной водой. При появлении первых признаков
реакции, но не более чем через 5 мин, мембранный фильтр переносят обратно на
среду Эндо. После четкого проявления реакции определяют результат. При
появлении фиолетово-коричневого или синего окрашивания (в зависимости от
примененного реактива) оксидазный тест считают положительным.

Если на фильтрах все колонии
оксидазоположительные, они не учитываются и выдают ответ об отсутствии ОКБ и
ТКБ и завершают анализ.

При отрицательной оксидазной
реакции проводят рассев до получения изолированных колоний и подтверждают их
принадлежность к ОКБ и ТКБ по п.п.8.2.3.3-8.2.3.4 (анализ качественный).

8.2.4. Учет результатов

8.2.4.1.Грамотрицательные
колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации
лактозы при температуре 37°С с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии
учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы
при температуре 44°С с образованием кислоты и газа.

8.2.4.2. При отсутствии общих
и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают
"не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл" и "не обнаружено КОЕ ТКБ в 100
мл".

8.2.4.3. В случае
идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих
единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ
в 100 мл воды.

Вычисление проводят по
формуле:

 

          a x 100

     X = —————————,

             V

 

 где: Х -число колоний в 100 мл;

      V- профильтрованный объем воды через
фильтры, на которых велся учет;

      a - число подсчитанных на этих фильтрах
колоний в сумме.

 

Примеры:

1. При посеве 3 фильтров по
100 мл выросло две колонии в 100 мл, на остальных двух фильтрах нет роста.
Число общих или термотолерантных колиформных бактерий будет:

 

     2 x 100

     ———————— = 0,7 КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл

      300

 

2. При посеве 10, 40, 100 и
150 мл на фильтрах с профильтрованным объемом 40 мл выросло 4 изолированные
колонии, с профильтрованным объемом 100 мл - 3 ОКБ. Фильтры с объемами 10 мл и
150 мл заросли и учету не подлежат.

Суммируют общее число колоний
ОКБ (ТКБ) на тех фильтрах, где получены изолированные колонии, и пересчитывают
на объем 100 мл.

 

     (4 + 3) x 100

     ————————————— = 5 КОЕ