an>

При использовании следует
руководствоваться рекомендациями фирмы-производителя.

Все обезвоженные коммерческие
питательные среды и препараты отечественного производства должны иметь сертификат
соответствия.

 

4.5.
Тест-культуры микроорганизмов

 

4.5.1. Контрольный колифаг
MS2, штамм ВКПМ-3254 E.coli К12 F+ Str(R) получают в ГНИИ Генетика -
Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ-Россия, 113545, г.Москва,
1-ый Дорожный проезд, д.1).

4.5.2. Штамм E.coli M17-02 и
один из штаммов: Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens получают в
Государственном Национальном Органе контроля медицинских и биологических
препаратов им.Л.А.Тарасовича Минздрава России (Россия, 121002, г.Москва,
ул.Сивцев Вражек, д.41).

 

Примечание.

В производственных
лабораториях, расположенных на территории водопроводных станции, следует
использовать штамм Pseudomonas fluorescens.

 

5.
Приготовление питательных сред и реактивов

 

5.1. Общие
положения

 

Предпочтительно использование
стандартизованных сухих питательных сред промышленного производства.

При использовании
промышленных сухих питательных сред их приготавливают в соответствии с
указаниями изготовителя на этикетке.

В этом случае следует
соблюдать способ применения и срок хранения питательных сред, указанные на
упаковках.

Сухие питательные среды
хранят в сухих помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые
упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные,
с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.

Для приготовления растворов,
реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТу 6709-72.

Питательные среды готовят в
посуде из инертного материала.

Учитывая возможное изменение
рН питательных сред после кипячения и стерилизации, окончательный контроль рН
проводят в готовой среде при температуре 25°С с использованием индикаторной
бумаги.

После стерилизации
питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. При
необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50 - 60)°С.

Температура сред, хранящихся
в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.

 

5.2.
Питательный бульон

 

5.2.1. Готовят из сухого
препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

5.2.2. Питательный бульон
(десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого
препарата, указанной на этикетке.

 

5.3.
Питательный агар

 

5.3.1. Готовят из сухого
препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

5.3.2. Питательный агар для
определения колифагов прямым методом готовят, увеличивая навеску сухого
препарата в 2 раза от прописи.

5.3.3. Питательный агар запрещается
выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным
агар повторному расплавлению не подлежит.

5.3.4. Полужидкий питательный
агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар
микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 мл дистиллированной
воды. Довести рН до 7,0 - 7,2, разлить в пробирки и стерилизовать
автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.

5.3.5. Питательный агар со
стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 мл
питательного агара, приготовленного по стандартной прописи. Стерильно на
стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации
10 мг на 1 мл. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до
температуры (45 - 49)°С, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина
из расчета 0,1 мл на 10 мл питательного агара. Разливают в пробирки для
приготовления скошенного агара. Повторное расплавление питательной среды со
стрептомицином запрещается.

 

5.4.
Фуксин-сульфитная среда Эндо

 

5.4.1. Основная модификация

Готовят из сухого препарата
по способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следы
влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить. Срок хранения чашек со средой
не более 2 - 3 суток в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.

5.4.2. Повышение
дифференцирующих свойств среды

Для повышения
дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60 - 70)°С среду
перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 мл среды 0,2 мл 5 %-ного
спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина - не
более 1 мес.

5.4.3. Модификация среды с
добавлением розоловой кислоты

В случаях, когда мембранные
фильтры зарастают микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы,
помимо фуксина, допускается добавление на 100 мл среды Эндо 0,2 мл 5 %-ного
спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты
- не более 1 мес.

Модификацию среды Эндо с
добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной
фильтрации.

 

5.5.
Лактозо-пептонная среда

 

10 г пептона, 5 г натрия
хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды.
После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4 - 7,6, разливают по 10 мл в
пробирки, стерилизуют при (112±2)°С 12 мин.

Для приготовления
концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды,
увеличивают в 10 раз, разливают по 1 мл в пробирки и по 10 мл во флаконы.

 

5.6.
Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу до
кислоты и газа

 

5.6.1. Полужидкая среда с
лактозой из сухого препарата

Готовят по способу,
указанному на этикетке.

Срок хранения - не более 2
недель при комнатной температуре.

Посев производят уколом до
дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в
соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается
или по уколу, или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При
инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на
присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды "карманы" -
потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

5.6.2. Полужидкая среда с
лактозой

Готовят при отсутствии сухого
препарата.

В 1 л дистиллированной воды
растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 4 - 5 г агар-агара, доводят до
кипения, устанавливают рН 7,2 - 7,4, добавляют 1 мл 1,6%-ного спиртового
раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при (120±2)°С 20 мин. В расплавленную
среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки
на высоту 3 - 5 см и стерилизуют при (112±2)°С 12 мин. Срок хранения - не более
2 недель при комнатной температуре.

Правильно приготовленная
среда зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). При
образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.

5.6.3. Лактозо-пептонная
среда

Готовят по п.5.5 с
добавлением 1 мл 1,6%-ного спиртового раствора бром-тимолового синего на 1 л и
разливают по 3 - 5 мл в пробирки с поплавком.

5.6.4. СИБ-лактоза

Готовят по прописи
завода-изготовителя.

 

5.7.
Реактивы для оксидазного теста

 

5.7.1. Вариант 1

1%-ный водный раствор
тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят перед употреблением.

5.7.2. Вариант 2

Реактив N 1. 1%-ный спиртовой
раствор альфа-нафтола.

Реактив N 2. 1%-ный водный
раствор фенилендиаминового соединения.

Растворы сохраняют в темных
флаконах с притертыми пробками: 1 - до одного месяца, 2 - до одной недели.
Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей
второго раствора.

Могут быть использованы
коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста (СИБ-оксидаза или
аналоги).

Перед работой с каждой серией
проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать с тест-культурами
микроорганизмов, дающих положительную (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens) и
отрицательную оксидазную реакцию (Е. coli).

 

5.8.
Железосульфитный агар

 

В 1000 мл стерильного
расплавленного питательного агара (по п.5.4) добавляют 10 г глюкозы, нагревают
до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при (112±2)°С 12 мин (основная среда).

20%-ный раствор сульфита
натрия (Na2SO3) и 8%-ный раствор железа серно-кислого закисного (FeSO4) или
железа хлористого (FeCl2) готовят непосредственно перед употреблением в
стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия
нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл
расплавленной основной среды вносят 5 мл 20%-ного раствора сульфита натрия,
перемешивают, затем вносят 1 мл 8%-ного раствора серно-кислого железа,
перемешивают и стерильно разливают в пробирки высоким столбиком 12 - 15 см для
работы методом мембранной фильтрации или во флаконы для работы методом прямого
посева.

 

5.9.
Реактивы для окраски препаратов по Граму

 

5.9.1. Карболовый раствор
генциана фиолетового готовят следующим образом: 1 г генциана фиолетового, 10 мл
ректификованного этилового спирта, 5 г фенола растирают в ступке, добавляя 100
мл дистиллированной воды.

5.9.2. Раствор Люголя готовят
следующим образом: 1 г йода, 2 г йодистого калия растворяют в 300 мл
дистиллированной воды. Хранить во флаконе из темного стекла.

5.9.3. Фуксин Циля готовят следующим
образом: 1 г основного фуксина, 10 мл спирта этилового ректификованного, 54 г
фенола растирают в ступке, добавляя 100 мл дистиллированной воды.

 

6.
Подготовка к анализу

 

6.1.
Подготовка посуды и материалов

 

Лабораторную посуду моют,
ополаскивают сначала водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают.

Пробирки, колбы, бутылки,
флаконы закрывают силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и колпачками
(силиконовые, металлические, из фольги или плотной бумаги).

Пипетки со вставленными
тампонами из ваты укладывают в металлические пеналы или заворачивают в бумагу.

Чашки Петри укладывают в
металлические пеналы или заворачивают в бумагу. Бумага, используемая для
обертывания лабораторной посуды, не должна разрушаться при стерилизации.

Подготовленную посуду
стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160°С в течение 2 ч или при 180°С
1 ч, считая с момента достижения указанной температуры. Стерильную посуду
вынимают из стерилизационного шкафа после его охлаждения ниже 60°С. Срок
хранения стерильной посуды - не более 10 дней.

Материалы и лабораторную
посуду, разрушающиеся при температуре (160 - 180)°С (резина и т.п.), следует
стерилизовать в паровом стерилизаторе при температуре (121±2)°С 20 мин.

Новые резиновые пробки
кипятят в 2%-ном растворе натрия двууглекислого 30 мин и 5 раз промывают
водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки
кипятят в дистиллированной воде 30 мин, высушивают, заворачивают в бумагу или
фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные
ранее, обеззараживают, кипятят 30 мин в водопроводной воде с нейтральным моющим
средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.

После выполнения анализа все
использованные чашки, пробирки и пипетки обеззараживают в автоклаве при
(126±2)°С в течение 60 мин, в исключительных случаях допускается
обеззараживание кипячением в 2%-ном растворе пищевой соды или 0,5 %-ном
растворе моющего средства в течение 60 мин с момента закипания (в закрытой
емкости с полным погружением в раствор).

 

6.2.
Подготовка проб воды

 

Перед посевом пробу тщательно
перемешивают и фламбируют горящим тампоном край емкости. Используемые пробирки
и чашки маркируют.

Перед каждым отбором новой
порции воды для анализа пробу перемешивают стерильной пипеткой.

 

7. Методика
работы при использовании мембранных фильтров

 

7.1.
Подготовка мембранных фильтров

 

Мембранные фильтры должны
быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.

 

7.2.
Подготовка фильтровального аппарата

 

Воронку и столик
фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом
ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального
аппарата кладут фламб