│                          │

                 \/                         \/

               Обработка хлороформом 30 - 40 минут

                  │                          │

                 \/                         \/

               Исследование методом агаровых слоев

        
┌────────┴───────┐         ┌────────┴───────┐

        \/              
\/        \/               \/

         L2A            
L4A       L2A              L4A

 

      Рис. 2. Схема постановки РНФ для обнаружения листерий.

 

8.6. При использовании смеси фагов из опытной и контрольной
пробирок (N 1 и 2) берут по 0,2 куб. см и переносят по 0,1 куб. см в две
пробирки, содержащие по 0,9 куб. см МПБ (один ряд для обнаружения фага L2A, а
другой - L4A), а затем из каждой пробирки готовят еще одно десятикратное
разведение.

8.7. Готовят взвесь штаммов I и II серогруппы по стандарту
мутности 10 ед. путем разведения суточной агаровой культуры в физиологическом
растворе. Во все пробирки с разведенным материалом добавляют по 0,1 куб. см взвеси,
штамма 1 серогруппы для выявления фага L2A или штамма II серогруппы для
обнаружения фага L4A.

Содержимое пробирок засевают методом агаровых слоев по Грациа.
Для этого накануне дня исследования в бактериологические чашки Петри разливают
по 10 куб. см 1,5%-ного МПА; МПА можно разлить в чашки Петри и в день
исследования, но в этом случае поверхность агара необходимо предварительно
подсушить в течение 40 - 50 мин. при 37 °C или 2 ч при комнатной температуре.
Для второго слоя используют расплавленный и охлажденный до 48 - 50 °C 0,7%-ный
МПА, который следует использовать в течение часа, так как позже он приобретает
гелеобразную консистенцию и непригоден для исследования.

Затем в пробирки пипеткой вносят по 2,5 - 3 куб. см
расплавленного и охлажденного до 48 - 50 °C 0,7%-ного МПА. Содержимое быстро и
тщательно перемешивают вращением пробирки между ладонями и выливают в чашку
Петри. Смесь легким покачиванием чашки равномерно распределяют вторым слоем на
поверхности 1,5%-ного МПА. Чашки оставляют на ровном месте на 20 - 30 мин. (до
застывания 0,7%-ного МПА), затем переворачивают и инкубируют при комнатной
температуре.

8.8. Учет реакции проводят через 16 - 24 ч инкубирования посевов.

В опытных пробах и контроле титра фага подсчитывают число
негативных колоний во всех чашках. Негативные колонии - округлые, хорошо
заметные на фоне бактериального роста, прозрачные участки, образующиеся в
результате лизиса бактерий.

При учете результатов сравнивают количество негативных колоний на
чашках соответствующих разведений.

8.9. Результаты реакции оценивают по увеличению титра
бактериофага (количества негативных колоний):

увеличение количества негативных колоний в опытной пробе по
отношению к контролю в 5 и более раз (хотя бы по одному из разведений)
оценивается как положительный результат, менее чем в 5 раз - отрицательный;

сплошной лизис или лизис с островками оценивается как
положительный результат.

8.10. При получении положительного результата РНФ дают
заключение, что в исследуемом материале (пробе) обнаружены бактерии рода Listeria.

 

9. Биологические исследования

 

Биологические исследования (постановку биопроб на мышах)
выделенных культур и их серологическую диагностику в реакции агглютинации
проводят в ходе противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании
заболеваний в соответствии с Методическими рекомендациями "Лабораторная
диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики". М.,
1987 (утв. 04.09.86) [16].

 

10. Требования безопасности

 

Исследования пищевых продуктов на наличие Listeria monocytogenes проводят
в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами
III - IV групп патогенности и гельминтами".

 

 

 

 

 

 

Библиографический список

 

1. Федеральный закон "О санитарно - эпидемиологическом
благополучии населения" от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ.

2. Положение о государственной санитарно - эпидемиологической
службе Российской Федерации, утвержденное Постановлением Правительства
Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.

3. Положение о государственном санитарно - эпидемиологическом
нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от
24 июля 2000 г. N 554.

4. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности
и пищевой ценности пищевых продуктов".

5. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора
проб для микробиологических исследований".

6. ГОСТ 26669-85 "Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка
проб для микробиологических анализов".

7. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования
микроорганизмов".

8. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов,
красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом
анализе".

9. ГОСТ 9225-84 "Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического
анализа".

10. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины,
баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки
и методы отбора проб".

11. ГОСТ 9958-81 "Изделия колбасные и продукты из мяса.
Методы бактериологического анализа".

12. ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы микробиологического
анализа".

13. ГОСТ 4288-76 "Изделия кулинарные и полуфабрикаты из
рубленого мяса. Правила приемки и методы испытания".

14. ГОСТ 7631-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные
и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки
качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний".

15. МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с
использованием микробиологического экспресс - анализатора "Бак Трак
4100" / Минздрав России. М., 1997.

16. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика
листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики" (утв. Минздравом
СССР 04.09.86).

17. "Инструкция по санитарно - микробиологическому контролю
тушек, мяса птицы, птицепродуктов, яиц и яйцепродуктов на птицеводческих и
птицеперерабатывающих предприятиях" (утв. Главветупромом; согл. зам.
Главного государственного санитарного врача СССР 30.08.90).

18. СанПиН 2.3.4.050-96 "Производство и реализация рыбной
продукции".

19. СанПиН 2.3.4.545-96 "Производство хлеба, хлебобулочных и
кондитерских изделий".

20. СанПин 2.3.4.551-96 "Производство молока и молочных
продуктов".

21. СанПиН 42-123-4423-87 "Нормативы и методы
микробиологического контроля продуктов детского питания, изготовленных на
молочных кухнях системы здравоохранения".

22. СанПиН 1.2.731-99 "Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

23. СанПиН 2.3.6.1066-01 "Санитарно - эпидемиологические
требования к организации торговли и обороту в них продовольственного сырья и
пищевых продуктов".

24. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за
содержанием микробиологических и химических загрязнителей в молоке и молочных
продуктах на предприятиях молочной промышленности" (утв. Минсельхозпродом
России, согл. Госкомсанэпиднадзором России 29.12.95).

25. "Санитарные правила для предприятий пищеконцентратной
промышленности" (утв. Минздравом СССР 01.03.76).

26. "Ветеринарно - санитарные правила для предприятий
(цехов) переработки птицы и производства яйцепродуктов" (утв. Минздравом
СССР 06.03.87).

27. "Инструкция по порядку и периодичности контроля за
содержанием микробиологических и химических загрязнителей в мясе, птице, яйцах
и продуктах их переработки" (утв. Минсельхозпромом России; согл.
Минздравом России 27.06.00).

28. "Инструкция по микробиологическому контролю производства
мороженого" (утв. ТК 186 по стандартизации (молоко и молочные продукты);
согл. зам. Главного государственного санитарного врача России 10.03.93).

29. "Инструкция по санитарно - бактериологическому контролю
производства маргарина и майонеза на предприятиях маргариновой
промышленности" (утв. Госагропромом СССР 21.11.88).

30. "Порядок санитарно - микробиологического контроля при
производстве мяса и мясных продуктов" (утв. Минсельхозпромом России
15.12.95).

31. "Инструкция по микробиологическому контролю производства
высокостойких безалкогольных напитков. ИК 10-5031536-105-91" (утв.
Госагропромом СССР; согл. Минздравом СССР 28.06.91).

32. "Инструкция по микробиологическому контролю
быстрозамороженной плодоовощной продукции" (утв. Госагропромом СССР; согл.
Минздравом СССР 29.09.89).

33. МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля
продуктов детского, лечебного питания и их компонентов".