/span>


+   


+   


- 


-   


+  




рамнозы    


+   


-   


-   


+/-


+/-  


+/- 




Бета -      
гемолиз     



+   



+   



+   



- 



-   



-  




КАМП-тест   
(CAMP-test).
Усиление    
гемолиза    
около штриха:
Rhodococcus
equi       








-   








+   








-   








- 








-   








-  




Staphylococ-
cus aureus 



+   



-   



+   



- 



-   



-  




Лецитиназная
активность: 
на среде с 
активирован-
ным углем  






+   






+   






-   






- 






-   






-  




на среде   
без угля   



-   



+   



-   



- 



-   



-  




 

Для видовой дифференциации выделенных культур листерий
допускается использовать биохимические тест - системы API Listeria фирмы
"BioMerieux". При их применении следует руководствоваться
рекомендациями изготовителя.

6.8.6. Наличие способности ферментировать рамнозу и ксилозу -
определяют аналогично п. 6.8.4. Бактерии L. monocytogenes утилизируют рамнозу с
образованием кислоты и не утилизируют ксилозу.

6.8.7. Бета - гемолитическую активность исследуемых культур
определяют по образованию зон просветления за счет растворения эритроцитов
вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара, приготовленного с
добавлением стерильной дефибринированной крови барана или кролика. Посевы на
кровяном агаре (п. п. 3.3.2.3, 4.2.6) термостатируют при 37 °C в течение 24 ч.

Listeria monocytogenes обладают бета - гемолитической активностью
(образуют узкие четкие зоны просветления вокруг колоний).

6.8.8. Постановку КАМП-теста проводят для дифференциации L.
monocytogenes от других видов листерий, обладающих гемолитической активностью.

Для проведения теста 2 - 3-суточные культуры геополитических
штаммов Staphylococcus aureus и Rhodococcus equi засевают на кровяной агар с
эритроцитами барана двумя параллельными штрихами на расстоянии 5,0 - 5,5 см,
как показано на рис. 1 <*>.

    --------------------------------

<*> Не приводится.

 

Между вертикальными штрихами St. aureus и Rh. equi засевают
параллельными штрихами исследуемые культуры листерий на расстоянии друг от
друга не менее 1 см и от вертикальных штрихов - 0,5 см. В качестве контрольных
используют тест - штаммы L. monocytogenes и L. ivanovii. Инкубацию проводят 24
ч при 37 °C. Отмечают форму и размеры зон гемолиза около вертикальных штрихов
роста стафилококка и родококка.

Listeria monocytogenes дает расширение зоны гемолиза около штриха
St. aureus (положительный КАМП-тест) и имеет отсутствие изменений зоны гемолиза
рядом со штрихом Rh. equi (отрицательный КАМП-тест).

6.8.9. Для определения лецитиназной активности дно двух чашек
Петри со средой ГРМ N 1, содержащих: 1 чашка - желток куриного яйца и
активированный уголь, 2 чашка - желток куриного яйца без активированного угля -
делят на несколько секторов или квадратов, исследуемые культуры и контрольные
штаммы листерий пересевают параллельно короткими штрихами на соответствующие
секторы чашек, содержащих и не содержащих уголь. Инкубируют 48 ч при 37 °C.
Чашки просматривают в проходящем свете и определяют наличие активности в
присутствии и в отсутствие активированного угля, сравнивая с контрольными
высевами музейных штаммов. Listeria ivanovii дает плотную зону помутнения
шириной 3 - 6 мм независимо от присутствия активированного угля. Listeria
monocytogenes дает аналогичную зону помутнения в присутствии активированного
угля и не дает при отсутствии угля. Другие виды листерий не дают зоны
помутнения.

6.9. Учет результатов

Результат оценивают по каждой исследованной пробе отдельно. В
образце продукта констатируют присутствие Listeria monocytogenes, если при
посеве на селективные среды выделены короткие неспорообразующие грамположительные
па ломки, каталазоположительные, подвижные при 25 °C и неподвижные при 37 °C,
утилизирующие эскулин, сбраживающие с образованием кислоты рамнозу и не
сбраживающие маннит и ксилозу, не восстанавливающие нитраты до нитритов,
обладающие бета - гемолитической активностью, дающие положительную реакцию в
КАМП-тесте со Staphylococcus aureus и отрицательную - с Rhodococcus equi,
проявляющие лецитиназную активность на среде ГРМ N 1 с добавлением желтка
куриного яйца и в присутствии активированного угля.

Результаты выявления Listeria monocytogenes в определенной
навеске продукта записывают: "Listeria monocytogenes обнаружены в 25 г
(куб. см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского, лечебного и
специализированного питания) продукта" или "Listeria monocytogenes не
обнаружены в 25 г (куб. см) (в 50 - 100 г - для продуктов детского, лечебного и
специального питания) продукта".

Результат оценивают по каждой пробе отдельно.

 

7. Проведение исследования с использованием

кондуктометрического анализатора "Бак
Трак"

 

7.1. Предварительное обогащение - 1 этап

 

Для предварительного обогащения используется среда Pre-Media
403A.

Необходимое количество продукта, в котором регламентируется
отсутствие L. monocytogenes, смешивают со средой Pre-Media 403A в соотношении
1/10, затем образец гомогенизируют и инкубируют в течение 24 ч.

 

7.2. Обогащение - 2 этап

 

Для обогащения используют одну из сред: BiMedia 401A, BiMedia
402A, BiMedia 403A.

Среду BiMedia 403A (401A, 402A) оставляют уравновеситься при
комнатной температуре в течение 12 ч. Устанавливают температуру 37 °C на
приборе "Бак Трак".

В основном меню программы "Бак Трак" устанавливают
следующие параметры.

 

      Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters)

 

 Время исследований (Duration)                  36 ч

 Масштаб измерений (Scale)

 М-параметр                                     0 - 20%

 Е-параметр                                     0 - 80%

 Время задержки (Delay)                         1 ч

 Пороговые значения (Thresholds)

 М-параметр                  
                  5%

 Е-параметр                                     15%

 Проводить учет результатов по Е-параметру

 Пороговое значение по времени (Time limit)     30 ч

 

Добавляют в каждую измерительную ячейку по 10 куб. см среды
BiMedia и вносят по 0,1 куб. см предобогащенного образца, тщательно
перемешивают содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивая).

Для контроля среды используют одну измерительную ячейку с 10 куб.
см среды BiMedia (без инокулята).

Выбирают в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start
Measurement) и начинают измерения.

После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как
свободная на экране монитора, измерительные ячейки помещают в прибор "Бак
Трак". Измерение начинается автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в
прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT)
записываются автоматически.

Учет результатов

Образец загрязнен листериями, если изменение импеданса превышает
15%-ное пороговое значение по Е-параметру в течение 30 ч.

Подтверждение Listeria - позитивных образцов. В случае
положительного ответа на листерии проводится подтверждение роста и
идентификация до L. monocytogenes с высевом на селективные питательные среды в
соответствии с п. п. 6.3 - 6.8. Высев производится непосредственно из
измерительной ячейки.

Выросшие культуры подвергают идентификации по п. 6.8.

Учет результатов и выдача ответа - по п. 6.9.

 

8. Выявление Listeria monocytogenes в реакции

нарастания титра фага (РНФ)

 

РНФ может быть использована в качестве дополнительного метода для
обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах (при проведении
противоэпидемических мероприятий и при эпидрасследовании).

Реакция нарастания титра фага - быстрый специфический метод
обнаружения листерий, обеспечивающий выявление возбудителя в исследуемом
материале без выделения культуры.

РНФ основана на свойстве индикаторного бактериофага строго
специфично размножаться в клетках гомологичного микроба. Размножение
бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и повышением
титра.

8.1. В реакции применяют листериозные бактериофаги L2A и L4A.
Штаммы L. monocytogenes - I (9 - 127) и II (9 - 72) серогрупп. Питательные
среды, содержащие 0,5% глюкозы: мясопептонный бульон, 1,5%-ный и 0,7%-ный
мясопептонный агар.

8.2. При постановке РНФ с пробами пищевых продуктов отвешивают 25
г исследуемого материала, измельчают, помещают в колбу емкостью 1000 куб. см и
добавляют 250 куб. см МПБ. Смесь в течение 5 - 10 мин. встряхивают, затем 9
куб. см переносят в бактериологическую пробирку N 1 (опыт).

    8.3. Бактериофаги  
используют  в  рабочем 
разведении  (10000

фаговых корпускул в 1
куб.  см).  Для этого их растворяют в МПБ до

исходного  объема, 
указанного на этикетке ампулы,  а
затем на МПБ

отдельными пипетками
делают  пять  последовательных 
десятикратных

разведений  (в 
последнем  разведении  титр 
бактериофага составит

      4

1 x 10 ).

Смесь фагов готовят путем смешивания равных объемов фага L2A и
L4A в рабочем разведении.

8.4. Для контроля титра бактериофага, который ставят один на
группу анализов, проводимых одновременно, в пробирку N 2 (контроль) вносят 9
куб. см МПБ.

8.5. В пробирки N 1 и 2 вносят по 1 куб. см смеси фага в рабочем
разведении (рис. 2) и выдерживают их в течение 16 - 24 ч при комнатной
температуре, после чего в пробирки добавляют по 1 куб. см хлороформа.
Содержимое тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 -
40 мин. Хлороформ оседает на дно, надосадочную жидкость подвергают дальнейшим
исследованиям.

 

 Исследуемый субстрат      
Смесь фагов       Мясопептонный
бульон

 

         │                      │ │                    │

        
└───────┐
┌────────────┘
└────────┐
┌─────────┘

                 │ │                       │ │

                \/ \/                     \/ \/

           N 1 - опытная          
N 2 - контроль смеси фагов

                  │                          │

                 \/                         \/

     Инкубация в термостате при 23 °C в течение 16 - 24 часов