анная                      ГОСТ 6709-72

 D-глюкоза, ч.                              ГОСТ 6038-79

 D-лактоза, 1-водная                        ТУ 6-09-22-98-79

 Маннит

 Ксилоза

 Рамноза

 Калия гидроокись                           ГОСТ 24363-80

 Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.    ГОСТ 4198-75

 Калий фосфорнокислый двузамещенный,

 3-водный                                   ГОСТ 2493-75

 Кислота соляная, х.ч.                      ГОСТ 3118-77

 Литий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а.   ГОСТ 4328-77

 Масло иммерсионное для микроскопии         ГОСТ 31739-78

 Набор реактивов для окраски по Граму

 Натрий-аммоний фосфорнокислый

 двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч.       ГОСТ 4170-78

 Натрия гидроокись, ч.д.а.                  ГОСТ 4328-77

 Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а.   ГОСТ 22280-75

 Натрий хлористый, ч. или х.ч., или ч.д.а.  ГОСТ 4233-77

 Пара-диметиламидобензальдегид, ч.          ТУ 6-09-3272-77

 Пептон сухой ферментативный для

 бактериологических целей                   ГОСТ 13805-76

 Полимиксин "М" или "В" сульфат по

 500000 ед. (медпрепарат)

 Спирт этиловый ректификованный

 технический                                ГОСТ 18300-87

 Спирт этиловый ректификованный             ГОСТ 5962-67

 Железа аммонийного цитрат

 Феноловый красный                          ГОСТ 5853-51

 Фенолфталеин                               ГОСТ 5850-72

 Фуксин основной                            ТУ 6-09-4119-75

 Хлороформ технический             
        ГОСТ 2-15-76-72

 Уксусная кислота                           ГОСТ 61-75

 Сульфаниловая кислота

 А-нафтол

 Цинк порошкообразный                       ГОСТ 3640

 Эскулин

 Экстракт дрожжевой сухой

 Лития хлорид

 Уголь активированный                       Р.72.270.3

 Желток куриного яйца

 Крахмал

 Налидиксовая кислота                       Lab M, HiMedia

 Акрифлавина гидрохлорид (трипафлавин)      Lab M, HiMedia

 Цефтазидим

 Циклогексимид

 Тест - штаммы Listeria monocytogenes,

 Listeria ivanovii, Listeria innocua,

 Staphylococcus aureus, Rhodococcus equi,

 типичные по культуральным, морфологическим

 и биохимическим свойствам

 

3.3.2. Среды питательные

 

3.3.2.1. Для культивирования изолятов

 

 Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон           ФС42-3377-97

                                            (ГНЦ ПМ)

 Среда ГРМ N 1                              ВФС 42-2988-97

                                            (ГНЦПН)

 Питательный бульон и питательный агар      ТУ 10-02-02-789-176-94

 Триптон - соевый агар с дрожжевым

 экстрактом (TSYEA)                         HiMedia M1214

 Триптон - соевый бульон с дрожжевым

 экстрактом (TSYEB)                         HiMedia M1263

 

3.3.2.2. Среды селективного обогащения

 

 Бульон Фрейзера (Fraser Broth)  
          BioMerieux 42046

 Бульон Фрейзера половинной концентрации

 (Half Fraser Broth)                        BioMerieux 42048

 Fraser Broth Base, Fraser Supplement,

 Fraser Selective Supplement                HiMedia M1327,

                                            FD 141, FE1251

 Бульон для обогащения Listeria Enrichment

 Broth                                      Merck 1.10549,

                                            HiMedia M569

 Бульон вторичного обогащения для листерий

 - Fraser Secondary Enrichment Broth Base   HiMedia M1083

 Селективный бульон для листерий -

 Listeria Selective Broth Base              HiMedia M889

 Среды Pre-Media 403A и BiMedia 401A,

 402A, 403A                                 Lab M

 

3.3.2.3. Дифференциально - диагностические

селективные среды

 

 PALCAM - Listeria Selective Agar Base с

 селективной добавкой 1.12122               Merck  1.1
1755

 PALCAM-агар - селективная среда для

 выделения листерий                         BioMerieux 43559

 Агар для идентификации листерий -

 Listeria Identification Agar Base

 (PALCAM)                                   HiMedia M1064

 Oxford - агар - селективная среда для

 выделения листерий                         BioMerieux 43 560

 Listeria Oxford Medium Base и Oxford

 Listeria Supplement                        HiMedia M1 145,

                                            FD 071

 Среды Гисса с маннитом, ксилозой, рамнозой ФС (ЦНИИВС

                                            им. И.И. Мечникова,

                                            НИИ питательных сред)

 Среда для определения подвижности

 листерий (Listeria motility medium)        HiMedia M1215

 SIM-агар (сероводород-индол - подвижность) Difco

 Blood Agar Base - основа кровяного агара   HiMedia M073

 Тест - системы биохимические для видовой

 идентификации API Listeria                 BioMerieux

 

Допускается использование других коммерческих питательных сред и
диагностических препаратов аналогичного назначения для проведения исследований
в соответствии с данным документом. При их применении следует руководствоваться
рекомендациями изготовителя.

Питательные среды и биологические препараты импортного
производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29
000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны
вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном
порядке.

 

4. Подготовка к анализу

 

4.1. Приготовление растворов и реактивов

 

4.1.1. Пептонно - солевой раствор - по ГОСТ 26669.

4.1.2. Изотонический (0,85%-ный водный) раствор хлорида натрия -
по ГОСТ 26669.

4.1.3. Растворы и реактивы для постановки реакции нитратредукции
- по ГОСТ 10444.8-99.

4.1.4. Приготовление растворов и реактивов для окраски препаратов
по Граму - по ГОСТ 10444.1 или в соответствии с инструкцией по применению.

4.1.5. Раствор перекиси водорода для определения каталазы 3%-ный
- по ГОСТ 30425.

 

4.2. Приготовление питательных сред

 

Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3.2,
готовятся согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями
фирмы.

Допускается применение сред лабораторного приготовления по п. п.
4.2.1- 4.2.10.

Приготовление питательных сред Pre-Media 403A и BiMedia 401A,
402A, 403A для определения листерий проводят в соответствии с МУК 4.2.590-96
"Бактериологические исследования с использованием микробиологического
экспресс - анализатора "Бак Трак 4100".

4.2.1. Питательный агар с 1% глюкозы и питательный бульон с 1%
глюкозы (МПА с 1% глюкозы, МПБ с 1% глюкозы) готовят в соответствии с ГОСТ
10444.1.

4.2.2. Триптон - соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) /
триптон - соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA)

Состав среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина - 17,0;
пептон соевый - 3,0; натрий хлористый - 5,0; фосфат калия однозамещенный - 2,5;
глюкоза - 2,5; дрожжевой экстракт - 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) -
15,0.

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды,
тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C
в течение 15 мин.

4.2.3. Среды селективного обогащения типа бульона Фрейзера

Приготовление основы среды (г/л): ферментативный гидролизат казеина
- 5,0; пептон - 5,0; мясной экстракт - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий
хлористый - 20,0; калия дигидрофосфат - 1,35; натрия гидрофосфат - 12,0;
эскулин - 1,0; литий хлористый - 3,0; железа аммонийного цитрат - 0,25
растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают,
устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C 15 мин.

Перед употреблением в основу среды вносят асептический раствор
селективных компонентов следующего состава:

4.2.3.1. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера первичного
обогащения <*>: налидиксовой кислоты - 10 мг, акрифлавина гидрохлорид -
12,5 мг растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.

    --------------------------------

<*> Допускается при приготовлении среды типа бульона
Фрейзера первичного обогащения готовить основу среды без добавления эскулина и
цитрата железа аммонийного.

 

4.2.3.2. Для приготовления среды типа бульона Фрейзера вторичного
обогащения: налидиксовой кислоты - 20 мг, акрифлавина гидрохлорид - 25 мг
растворить в 10 куб. см стерильного 0,2 N гидроксида натрия.

Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят
в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.4. PALCAM-агар (полимиксин-акрифлавин-лития
хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол-агар) - селективная дифференциально -
диагностическая среда для выделения листерий

Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный -
23,0; дрожжевой экстракт - 3,0; крахмал - 1,0; натрия хлорид - 5,0; эскулин -
0,8; лития хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; маннит -
10,0; феноловый красный - 0,08; агар - 15,0 растворяют в 1000 куб. см
дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и
автоклавируют при 121 °C 15 мин.

К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически
раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавин - 0,005;
полимиксин "В" - 100000 ед.; цефтазидим - 0,02 в 10 куб. см
стерильной дистиллированной воды.

Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в
защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.5. Селективная дифференциально - диагностическая среда для
выделения листерий типа Оксфорд - агара

Приготовление основы среды (г/л): пептон мясной ферментативный -
23,0; крахмал кукурузный - 1,0; натрия хлорид - 15,0; эскулин - 1,0; лития
хлорид - 15,0; железа аммония цитрат - 0,5; глюкоза - 0,5; агар - 15,0
растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают,
устанавливают pH 7,0 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C 15 мин.

К стерильной расплавленной основе среды добавляют асептически
раствор селективных компонентов следующего состава: акрифлавина гидрохлорид -
0,005; циклогексимид - 0,4, колистина сульфат <*> - 0,02, цефатетан
<*> - 0,002, фосфомицин <*> - 0,01 мг в 10 куб. см 50%-ного
этилового спирта.

    --------------------------------

<*> Допускается замена комплекса перечисленных антибиотиков
на полимиксин в количестве 500000 ед. на 1 л.

 

Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в
защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.6. Кровяной агар

К растопленному и охлажденному до 45 - 50 °C питательному агару с
1% глюкозы (п. 4.2.1) добавляют 5% по объему дефибринированной крови животных.
Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 куб. см среды и подсушивают при
37 °C.

Засев производят в теплые чашки.

4.2.7. Питательный агар с эритроцитами барана

Дефибринированную или стабилизированную цитратом кровь барана
центрифугируют в асептических условиях 30 мин. при 900 об./мин. Надосадочную
жидкость сливают. Осадок суспендируют в стерильном физиологическом растворе до
первоначального объема, добавляют в количестве 5% по объему к растопленному и
охлажденному до 45 - 50 °C питательному агару (п. 4.2.1). Разливают в чашки
Петри по 10 куб. см, подсушивают при 37 °C. Чашки используют для посева
теплыми.

4.2.8. Среда для определения подвижности

20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного
ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды,
устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5 - 7 куб. см и
автоклавируют при 121 °C 15 мин.

4.2.9. Среды Гисса по ГОСТ 10444.1 с маннитом, рамнозой, ксилозой

10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в
1000 куб. см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода.
Устанавливают pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно
использование индикатора бромкрезолового пурпурного, "ВР" и др.),
разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °C в течение 20 мин.

4.2.10. Среда для определения лецитиназной активности листерий

К среде ГРМ N 1 перед стерилизацией добавляют активированный уголь,
растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5% (вес / объем).
Желток куриного яйца разводят в 150 мл физиологического раствора и добавляют 5%
по объему к стерилизованному и охлажденному до 40 - 50 °C питательному агару.
Разливают в чашки Петри по 20 куб. см и подсушивают при 37 °C. Аналогично
готовят среду с добавлением желтка, но без до