100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл и устанавливают
в каждой емкости наличие ОКБ и ГКБ, как указано выше.

При определении ОКБ учитывают емкости, при высеве из которых на
среде Эндо обнаружены типичные колонии.

При определении ГКБ учитывают в сумме емкости, где на секторах
среды Эндо обнаружены типичные колонии ОКБ, а также розовые, при
газообразовании в среде накопления выдают ответ: НВЧ КОЕ ОКБ в 100 мл или НВЧ
КОЕ ГКБ в 100 мл.

Результаты определяют по таблице МУК 4.2.1018-01.

Примечания. В соответствии с СанПиН единицей измерения ОКБ ГКБ и
ТКБ является 100 мл, а норматив по этим показателям - отсутствие колиформных
бактерий в 300 мл.

Норматив - это научно обоснованная величина, указывающая (при его
соблюдении) на вероятность обеспечения эпидемической безопасности
водопользования в отношении кишечных инфекций.

Единица измерения 100 мл условно принята для выражения
количественного результата в целях сопоставления данных на международном
уровне, а также при исследовании воды различных объектов и при работе разными
методами (мембранным или титрационным). При работе титрационным методом
результат может быть высчитан только на 100 мл в соответствии с международными
статистическими таблицами расчета НВЧ (наиболее вероятного числа)
микроорганизмов.

 

 

 

 

 

 

Приложение 9

 

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

 

Приготовление питательных сред

 

    Среда Бонде

 

    Натрий лимоннокислый трехзамещенный                       28 г

    Натрий-аммоний фосфорнокислый                             15 г

    Калий фосфорнокислый однозамещенный                       10 г

    Магний сернокислый (сульфат магния)                        2 г

    Вода дистиллированная                                  1000 мл

 

Ингредиенты растворяют при нагревании, стерилизуют при 1 атм. 20
мин. Перед посевом добавляют 5 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического
фиолетового на 100 мл среды.

Среда "Блеск"

100 мл питательного агара, стерильного, приготовленного из сухого
препарата по прописи на этикетке, расплавляют на водяной бане. После охлаждения
до температуры (приблизительно) 50 °C добавляют 0,3 г L-аргинина, 8 мл 10%
водного раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), 10 мл стерильного
обезжиренного теплого молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки
нетонким слоем (не менее 25 мл).

 

Выполнение анализа

 

Исследуют пробу воды объемом 1000 мл, разделенную в две емкости
по 500 мл. В каждую емкость добавляют по 50 мл среды Бонде, тщательно
перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48
часов.

Через 24 часа просматривают посевы. При наличии роста Pseudomonas
aeruginosa происходит помутнение среды Бонде и на поверхности появляется тонкая
прозрачная пленка, часто поднимающаяся по стенке емкости. В журнале отмечают
помутнение среды и образование пленки.

Для подтверждения Pseudomonas aeruginosa делают посев на среду
"Блеск". Емкость перед посевом не взбалтывать. Петлей забирают пленку
и делают посев штрихом для получения изолированных колоний и по 3 - 4 бляшки из
каждой емкости. Посев в виде бляшки: делают укол петлей до дна чашки и затем
растирают небольшую площадку вокруг укола по поверхности среды. Допустимо
делать посев нескольких проб на секторах одной чашки. Посевы со средой
"Блеск" инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 часов.

Емкости со средой Бонде оставляют в термостате еще на 24 часа для
окончательного учета.

Через 24 часа отмечают характер роста на среде "Блеск".
При наличии в пробе Ps. aeruginosa на среде "Блеск" вырастают
темно-красные колонии с золотистым блеском или золотистыми вкраплениями на
"бляшках". Появление блеска можно наблюдать уже через 20 - 22 часа инкубации
при температуре 37 °C, но максимального развития реакция достигает через 42 -
44 часа.

Если на среде "Блеск" не отмечено роста или выросли
колонии темно-красные, темно-вишневые, но без характерного блеска, то из
емкостей, где отмечено помутнение или помутнение с пленкой, высев следует
повторить через 48 часов.

При отсутствии роста в среде Бонде через 24 часа пробу инкубируют
до 48 часов и в случае помутнения и образования пленки подтверждают Ps.
aeruginosa на среде "Блеск", как указано выше.

Подтвердить наличие Ps. aeruginosa также можно путем посева
подозрительной изолированной колонии на косяк с питательным агаром, на котором
через 24 часа инкубации при температуре 37 °C в случае положительной реакции
появляется синий, сине-зеленый, зелено-желтый пигмент. Пигментация может
усиливаться при последующем выдерживании косяка на свету при комнатной
температуре.

Отрицательный ответ выдают:

- при отсутствии признаков роста в посевах пробы в среду Бонде;

- при отсутствии роста на среде "Блеск";

- при росте на среде "Блеск" не характерных для Ps.
aeruginosa колоний без блеска.

Результат сообщают: Ps.aeruginosa не обнаружена в 1000 мл воды.

Положительный ответ выдают:

- при росте на среде "Блеск" темно-красных колоний с
золотистым блеском;

- при образовании характерного пигмента на питательном агаре.

При четкой реакции на среде Бонде (муть и пленка) и среде
"Блеск" наличие пигмента определять не обязательно.

Результаты вносят в протокол анализа: Ps. aeruginosa обнаружена в
1000 мл воды.

 

 

 

 

 

 

Приложение 10

(обязательно)

 

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ВОДЕ

 

Принцип метода определения колифагов

 

Метод заключается в предварительном размножении колифагов в среде
обогащения в присутствии E. coli и последующем его выявлении в виде зон лизиса
(просветления) на газоне E. coli на питательном агаре.

 

Выполнение анализа при определении колифагов

 

Подготовка посуды, питательных сред (питательный агар готовят по
способу, указанному на этикетке), мембранных фильтров, ведение культуры E.
coli, методика подтверждения фаговой природы лизиса выполняется на МУК
4.2.1018-01.

Накануне проведения анализа культуру E. coli засевают в две
пробирки со скошенным агаром. Через 18 +/- 2 ч инкубации при температуре 37 +/-
1 °C производят смыв бактерий с косяков 5 мл стерильного физиологического
раствора и по стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 109
бактериальных клеток в мл.

В исследуемую воду объемом 1000 мл вносят 100 мл 10-кратного
питательного бульона и 10 мл смыва E. coli. Для контроля культуры 0,1 мл смыва
E. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Подготовленную пробу воды и чашку Петри с контролем E. coli
помещают в термостат и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18
+/- 2 ч.

После инкубации, при отсутствии колифагов на контрольной чашке, в
стерильную пробирку отливают 10 мл и эту пробу освобождают от бактериальной
флоры одним из двух методов.

1. В 10 мл пробы добавляют 1 мл хлороформа, пробирку закрывают
стерильной резиновой или силиконовой пробкой, энергично встряхивают в течение 3
- 5 минут для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставляют
на 15 минут при комнатной температуре для полного осаждения хлороформа. Для
дальнейшего исследования отбирают 1 мл пробы, не касаясь хлороформа.

2. 10 мл пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером пор
0,45 мм, подготовленный по п. 7.1 МУК 4.2.1018-01. Фильтрат в объеме 1 - 2 мл
отбирают в стерильную пробирку, помещенную в колбу Бунзена или непосредственно
в стерильную колбу Бунзена. Полученный фильтрат используют для дальнейшего
исследования.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45 °C питательный
агар добавляют приготовленный смыв бактерий E. coli из расчета 1,0 мл смыва на
100 мл агара. В стерильную чашку Петри пипеткой переносят 1 мл пробы
освобожденной от сопутствующей бактериальной флоры одним их двух предложенных
методов. Сверху пробу заливают подготовленным агаром. В качестве контроля E.
coli дополнительно заливают одну стерильную чашку Петри. Залитые чашки
осторожно покачивают для равномерного распределения агара. После застывания
агара чашки переворачивают и помещают в термостат на 18 +/- 2 ч при (37 +/- 1)
°C.

Если исследуется несколько проб, то целесообразно использовать
одну чашку Петри, которую необходимо залить агаром с E. coli. После застывания
агара разделить его поверхность на сектора (не более 6), пронумеровать их
согласно количеству исследованных проб. На каждый сектор нанести каплю
микропипеткой или штрихом стерильной бактериологической петлей из исследуемой
пробы воды, оставив один сектор в качестве контроля.

 

Учет результатов

 

Просмотр чашек после инкубирования осуществляется в проходящем
свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса газона E. coli,
наличии отдельных зон лизиса или единичных бляшек на чашке с исследуемой пробой
воды при отсутствии зон лизиса или отдельных бляшек на контрольной чашке или
контрольном секторе.

В протоколе отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в
1000 мл воды.

При наличии зон лизиса в контроле результат считается
недействительным. Анализ следует повторить с новой культурой E. coli.

 

 

 

 

 

 

Приложение 11

(обязательное)

 

КОНТРОЛЬ ЗА СОДЕРЖАНИЕМ ООЦИСТ КРИПТОСПОРИДИЙ В
ВОДЕ

 

Очищенная вода не должна содержать ооцист криптоспоридий.
Исследование проводят в соответствии с МУК 4.2.964-00 (п. 2.1). Далее
полученный осадок распределяют равномерно на предметных стеклах (не менее 4) и
высушивают на воздухе. На тщательно высушенный мазок наносят 2 - 3 капли смеси
Никифорова (смесь равных частей серного эфира и 96° этилового спирта) на 8 - 12
минут. После чего предметные стекла ставят вертикально и тщательно высушивают.

После этого мазки быстро проводят над пламенем горелки и
окрашивают карболовым фуксином (см. раздел 4.3) в течение не менее 20 минут.
Мазки промывают дистиллированной водой, обесцвечивают (дифференцируют) 5 -
10%-ной серной кислотой в течение 10 - 20 секунд и снова промывают. Затем
дополнительно окрашивают 0,2%-ным водным раствором метиленового синего или 5%
малахитовой зелени в 10% этиловом спирте в течение 3 - 5 минут. Промывают
дистиллированной водой, тщательно высушивают на воздухе и исследуют с масляной
иммерсионной системой микроскопа с увеличением не менее 1000 x.

Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в разные оттенки
ярко-красного (малинового, вишневого) цвета и имеют вид округлых образований
диаметром 5 - 6 микрон с отчетливо видимой оболочкой и структурированным
содержимым (можно наблюдать наличие 4 веретенообразных темноокрашенных
спорозоитов) на синем или зеленом основном фоне.

 

 

 

 

 

 

Приложение 12

(рекомендуемое)

 

СХЕМА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ

НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ПРОИЗВОДСТВА РАСФАСОВАННОЙ
ВОДЫ

(ПРИ СОКРАЩЕННОМ АНАЛИЗЕ В КАЖДОЙ ПАРТИИ И
СОКРАЩЕННОМ

ПЕРИОДИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ)

 




N
п/п


Места отбора    


Показатели     


Периодичность
отбора проб




1


2         


3         


4     




1 


Исходная вода        


ОМЧ при температуре  
37 °C                


1 раз в неделю




Колиформы <*>        




Pseudomonas          
aeruginosa <**>      


1 раз в месяц




Клостридии <***>     




2 


Накопительный резер- 
вуар до водоподготовки


ОМЧ при 37 °C и 22 °C


1 раз в неделю




Колиформы <*>        




3 


Каждый этап          
водоподготовки       


ОМЧ при 37 °C        


1 раз в неделю




4 


После очистки и      
обеззараживания      


ОМЧ при 37 °C        


1 раз в неделю




Колиформы <*>