ед. Обязательным условием поставки
питательных сред является наличие следующих сопроводительных документов:

1. Копии сертификата соответствия на реализуемую среду.

2. Паспорта отдела контроля организации-изготовителя на
реализуемую серию препарата.

3. Инструкции по применению.

Среды импортного производства должны иметь сертификаты качества
серии ISO 9000.

При получении питательных сред необходимо проверить целостность
упаковки (оценивается визуально) и наличие сопроводительной документации
(сертификата соответствия, паспорта, инструкции по применению, этикеток на
упаковках). Сопроводительная документация должна содержать следующую
информацию:

- название среды и ее назначение;

- название предприятия-изготовителя;

- номер серии;

- номер протокола контрольных испытаний;

- дата изготовления;

- срок годности;

- состав среды;

- условия хранения;

- рецептура приготовления;

- описание внешнего вида и консистенции сухой и готовой среды;

- условия и длительность хранения готовой среды.

Обо всех обнаруженных отклонениях необходимо сообщить
руководителю лаборатории.

 

11.2. Контроль условий и сроков хранения

питательных сред

 

Данный этап контроля позволяет обеспечить правильность и
постоянство условий хранения сред, а также своевременное пополнение их запаса.

Контроль осуществляют 1 раз в неделю или чаще.

Сухие питательные среды и реактивы, если не указаны особые
условия хранения, необходимо поместить в сухое, защищенное от света место с
температурой воздуха 10 - 25 °C.

Материалы, требующие пониженной температуры хранения, необходимо
поместить в холодильник с соответствующей степенью охлаждения.

Особое внимание следует уделить сохранению герметичности вскрытых
упаковок со средами, т.к. повышение влажности и комкование сухой питательной
среды существенно ухудшает ее качество. Если питательная среда упакована в
пакет из ламинированной бумаги и весь объем среды не используется за один раз,
то после вскрытия пакета оставшуюся часть среды желательно перенести в чистую
сухую емкость оранжевого стекла (или другого светозащитного инертного материала)
с плотно закрывающейся крышкой.

Готовые питательные среды хранят при температуре (2 - 8) °C. Срок
хранения готовой питательной среды определяется изготовителем.

Сухие питательные среды с истекшим сроком годности, но с
неизменившимися цветом и консистенцией, подвергают количественным методам
контроля питательных сред по биологическим показателям с целью принятия решения
о продлении срока годности.

Все приготовленные среды следует промаркировать с указанием
названия среды, а также даты приготовления и срока годности. Дату приготовления
питательной среды заносят в журнал (Прилож. 8.1).

Контейнеры (флаконы) с завинчивающимися крышками более пригодны
для продолжительного хранения готовых жидких и плотных питательных сред, нежели
чашки Петри или емкости с ватно-марлевыми пробками.

Температуру воздуха в местах хранения питательных сред проверяют
1 раз в неделю. Результаты проверки заносят в журнал регистрации температур.

 

11.3. Контроль питательных сред

на этапе приготовления

 

Для приготовления питательных сред и растворов, используемых в
микробиологическом анализе, допускается применение химических веществ по
степени чистоты не ниже ЧДА. Требования к качеству воды для приготовления
питательных сред для микробиологических анализов изложены в разделе 7.

При условии, что приобретена продукция надлежащего качества,
одним из основных факторов, определяющих качество и дальнейшую пригодность
питательной среды, является правильность ее приготовления.

Приготовление сред должно осуществляться со строгим соблюдением
рецептуры приготовления и условий стерилизации, определенных изготовителем.

Контроль питательных сред на этапе приготовления включает:

- оценку внешнего вида готовой среды;

- измерение pH готовой среды;

- определение стерильности (отсутствия контаминации) готовой
среды;

- постановку качественного контроля биологических свойств среды
(раздел 11.4.1).

Контроль питательных сред на этапе приготовления проводят каждую
варку.

 

11.3.1. Оценка внешнего вида готовой среды

 

Оценку внешнего вида питательной среды проводят визуально.

Цвет, прозрачность и консистенция сухой и приготовленной среды
должны быть типичны для данного продукта и соответствовать описанию
изготовителя.

Некоторыми очевидными ошибками при приготовлении сред являются:

- потемнение среды вследствие перегревания и недостаточного
перемешивания;

- неполное растворение порошкообразной среды;

- образование осадка.

В агаризованных средах осадок может образовываться вследствие
продолжительной стерилизации, повторных плавлений твердого агара или
длительного содержания расплавленного агара при высокой температуре.

В этих случаях появление осадка свидетельствует о непригодности
питательной среды.

Кроме того, агаризованные среды могут образовывать хлопьевидный
осадок, если расплавленная среда остается в водяной бане при температуре от 43
до 45 °C более 30 мин., вследствие начинающегося процесса застывания агара.
Такой хлопьевидный осадок агара можно рассеять путем повторного нагревания
среды до 60 °C.

 

11.3.2. Измерение pH

 

Значение водородного показателя определяют с помощью pH-метра,
для агаризированных сред - бумажной индикаторной системы с шагом измеряемого
диапазона не более 0,3 единиц. Определение проводят согласно инструкции по
использованию прибора или индикаторной системы.

Величину водородного показателя измеряют у стерилизованной среды,
а при работе с плотной средой измеряют у стерилизованной среды после ее
отвердения. Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).

Отклонение pH среды за пределы диапазона, указанного в паспорте,
приводит к ухудшению ее биологических свойств, вплоть до полной непригодности.

Отклонения водородного показателя или другие проблемы с pH могут
быть вызваны:

- перегревом;

- недостаточным перемешиванием;

- чрезмерной стерилизацией;

- использованием щелочного стекла;

- загрязнением емкостей, в которых готовилась среда;

- дистиллированной водой низкого качества.

 

11.3.3. Определение стерильности

 

Определение стерильности (для стерилизуемых сред) и отсутствия
контаминации (для нестерилизуемых сред) проводят путем инкубации чашки или
пробирки с исследуемой средой в термостате при температуре и в течение времени,
определенных для этих сред методическими документами по исследованию воды.

По истечении срока инкубации на (в) исследуемых питательных
средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста
микроорганизмов.

Результаты регистрируют в журнале (Прилож. 8.1).

 

11.4. Контроль биологических свойств

питательных сред

 

Оценка биологических (ростовых) свойств питательных сред
проводится по следующим показателям.

Чувствительность - максимальное разведение тестовой культуры, при
котором на всех засеянных чашках (во всех пробирках) обнаруживается рост.

Скорость роста - минимальное время инкубации после посева
культур, достаточное для визуального выявления роста (выражается в часах).

Дифференцирующие свойства - оцениваются по выраженности основных
отличительных признаков, характеризующих рост тестовых штаммов на данной
питательной среде.

Кроме того, для дифференциальных сред необходимо определять
ингибирующее действие среды. Ингибирующее действие среды определяется как в
отношении основного тестового микроорганизма, так и по отношению к
сопутствующим микроорганизмам.

Оценка ингибирующих свойств проводится по двум показателям.

Процент извлекаемости - процентное соотношение среднего значения
количества колоний, выросших на исследуемой среде, к среднему значению
количества колоний, выросших на контрольной среде.

Показатель ингибиции - степень подавляющего воздействия на
постороннюю микрофлору, выражается минимальным разведением, при котором полностью
отсутствует рост посторонней флоры.

Основным тестовым микроорганизмом для оценки биологических
свойств среды, используемых для текущего санитарно-бактериологического контроля
воды, является E.coli.

Дополнительно используются следующие тест-штаммы:

- для выявления дифференцирующих свойств среды - Shigella sonnei
"S-form" в качестве вида, не ферментирующего лактозу;

- при определении показателя ингибиции посторонней микрофлоры -
Staphylococcus aureus.

Контроль биологических свойств готовых питательных сред включает
два этапа: качественный и количественный контроль, каждый из которых имеет свое
целевое предназначение.

Задачей качественного контроля является выявление грубых
нарушений технологии приготовления, приводящих к выраженному снижению ростовых
и (или) дифференцирующих свойств. Качественный контроль проводят после каждой
варки среды.

Количественный контроль позволяет выявлять относительные
изменения (ухудшение) ростовых свойств из-за ряда причин, возникающих на этапах
транспортирования, хранения, приготовления, стерилизации, а также при изменении
технологических требований в процессе производства питательных сред, в
результате которых они оказываются менее эффективными.

Количественный контроль выполняется:

- при поступлении каждой новой партии среды;

- при необходимости решения вопроса о продлении срока годности
среды либо возможности ее дальнейшего использования в случае выявления
нарушений условий хранения.

Учитывая, что разные серии питательных сред одного производителя
иногда имеют различие по качеству, контролю подлежит каждая серия среды
поступившей партии.

Количественный контроль также может служить инструментом выбора
более эффективной среды среди продукции, предлагаемой на современном рынке.

 

11.4.1. Качественный контроль

 

В процессе качественного контроля оценивают принципиальную
способность основного тестового штамма расти на данной среде, а также наличие
характерных дифференцирующих признаков для специфических сред.

Качественный контроль выполняется лабораторией после каждой варки
питательной среды.

 

Методика исследования

 

Накануне исследования тестовую культуру готовят, как указано в п.
10.2.4.

Контроль выполняют путем посева тестового штамма в жидкие,
полужидкие или на плотные питательные среды с помощью общепринятых методик. Для
плотных сред метод посева должен обеспечивать получение изолированных колоний
микроорганизмов (например, метода "штриха"). Пробирки и чашки с
посевами инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

 

Оценка результатов качественного контроля

 

Среду считают пригодной, если по истечении срока инкубации
тестовый штамм дает хорошо различаемый рост со всеми типичными для него
отличительными признаками, которые предполагается выявлять на данной среде.

Этими признаками могут быть: помутнение жидкой или полужидкой
среды, изменение цвета, образование газа, отличительная форма, структура,
окраска колоний, наличие и диаметр зоны изменения цвета и прозрачности среды
вокруг колоний. Результаты качественного контроля заносят в журнал (Прилож.
8.1).

 

11.4.2. Количественный контроль

 

Выполнение количественного контроля должно осуществляться
лабораторией, имеющей лицензию на работу с необходимыми патогенными
микроорганизмами, аттестованной (аккредитованной) в этой области и
располагающей персоналом соответствующей квалификации.

 

11.4.2.1. Подготовительный этап

 

Питательные среды

 

Для исследования следует использовать свежеприготовленные среды
одной варки. Исследуемые и контрольные среды готовят согласно инструкции
изготовителя.

Среды, предназначенные для прямого поверхностного посева,
разливают в чашки Петри слоем не менее 2 мм и предварительно асептически
подсушивают одним из следующих способов:

1. Перевернутые чашки Петри с открытыми крышками выдерживают в
термостате или сушильном шкафу при температуре 25 - 50 °C до исчезновения
капель влаги с поверхности агара. Не пересушивать!

2. Закрытые неперевернутые чашки Петри выдерживают в ламинарном
боксе в течение ночи.

3. Чашки Петри с полуоткрытыми крышками помещают в ламинарный
бокс на 30 мин.

В качестве неселективной среды при определении ингибирующих и
дифференцирующих свойств контролируемой среды используют мясопептонный агар,
питательный агар на основе гидролизата кильки, рыбной муки (ГРМ-агар) и их
аналоги.

 

Разбавитель

 

Для исследования необходимо использовать стерильный
физиологический раствор, содержащий 0,1% (по массе) пептона. Это сводит до
минимума воздействие разбавителя на микроорганизмы. При невозможности
приготовления данного разбавителя допускается использование стерильного
физиологического раствора без пептона.

 

Подготовка инокулята

 

    За два  дня  до 
исследования тестовую культуру микроорганизма

пересевают  со 
среды  хранения  на 
скошенный  питательный   агар

согласно  п. 
10.2.4.  На  следующий день   из полученной агаровой

культуры с
использованием  стандарта  мутности 
готовят  суспензию

                                                                 9

тестового  штамма 
в  стерильном  разбавителе 
с концентрацией 10

кл/мл  и 
десятикратные  серийные  разведения 
(по  8   разведение