просмотренных колоний

 

    Если процент диссоциированных колоний превышает 25%, то данная

культура не пригодна для дальнейшего
использования.

    В связи   с  полиморфизмом  колоний  для  штаммов 
Pseudomonas

                                                           +

aeruginosa и Pseudomonas
fluorescens,  а также E.coli К12 F  Str-r

оценка R-S-диссоциации не
проводится.

 

                 10.4.2. Контроль видовых свойств

                                           +

               E.coli M17-02 и E.coli К12 F  Str-r

 

После восстановления лиофилизированной культуры проводится
типирование культуры по биохимическим свойствам до вида.

Идентификацию рекомендуется проводить с использованием
тест-систем биохимической идентификации семейства Enterobacteriaceae,
разрешенных к применению. При этом следует руководствоваться рекомендациями
производителя. Правомочна постановка отдельных биохимических тестов.

Перед очередным ежеквартальным созданием запаса рабочей культуры
оценку эталонного штамма E.coli проводят путем подтверждения следующих основных
свойств:

- отсутствие оксидазной активности;

- грам-негативности;

- способности образовывать на среде Эндо характерные
темно-красные (малиновые) колонии с металлическим блеском и отпечатком на
среде;

- способности утилизировать лактозу до кислоты и газа при
температуре 37 и 44 °C в течение 24 - 48 часов;

- способность утилизировать глюкозу до кислоты и газа при
температуре 37 °C в течение 24 часов.

Если культура не соответствует видовым свойствам или выявлено
наличие посторонних микроорганизмов, то она не пригодна для дальнейшего
использования.

 

                10.4.3. Проверка чувствительности

                                +

                    E.coli К12 F 
Str-r к фагу

 

                               +

    Способность E.coli  
К12  F   Str-r  лизироваться  специфичным

фагом,  являющимся основополагающим  свойством 
тест-культуры,  на

котором основан метод
определения колифагов в воде.

                                                +

    Контроль чувствительности  
E.coli   К12   F   
Str-r  к  фагу

осуществляется каждый раз,
когда из запасов хранения берется новая

пробирка с рабочей культурой
на полужидком агаре.

 

                        Выполнение анализа

 

                                      +

    Бактериальную взвесь 
E.coli К12 F  Str-r готовят по
стандарту

мутности,  как указано в разделе  9. 
На  100 мл расплавленного  и

остуженного  до 
45  -  49  °C  питательного  агара  вносят  1  мл

бактериальной взвеси и
разливают в чашки.  После
застывания  чашки

на  поверхность 
агара  наносят каплю (0,05 мл)
суспензии фага (не

захватывая
хлороформа).  Инкубируют  при 
37  °C  18  -  24 
часа.

Просмотр посевов следует
осуществлять в проходящем свете.

    Культура считается 
восприимчивой  и  пригодной для проведения

анализов воды при наличии
четких зон лизиса.

    При отсутствии  
зон   лизиса   культура  
не   пригодна   для

использования и подлежит
замене.

 

                    10.4.4. Проверка культуры

                       +

           E.coli К12 F 
Str-r на загрязненность фагом

 

                                     +

    Бактериальную взвесь E.coli К12 F   Str-r готовят по стандарту

мутности,  как указано в  разделе  9,  вносят 
в  расплавленный  и

остуженный до температуры
45 - 49 °C питательный агар из расчета 1

мл взвеси на 100 мл
агара.  Чашку  Петри  заливают  приготовленной

смесью, инкубируют при
температуре 37 °C 18 - 24 часа.

Посевы просматривают в проходящем свете. Культура должна давать
равномерный газон роста. Наличие зон лизиса в контроле свидетельствует о
загрязненности культуры фагами.

Загрязненная культура не пригодна для дальнейшего использования.

 

10.4.5. Контроль видовых свойств

Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens

 

Оценку эталонного штамма Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas
fluorescens проводят путем подтверждения следующих свойств:

- наличия оксидазной активности;

- грам-негативности;

- роста на ПБ в виде серебристой пленки на поверхности с
образованием кольца сине-зеленого пигмента;

- наличия сине-зеленого пигмента пиоцианина при росте на ПА при
37 °C;

- способности роста на питательном агаре при 42 °C в течение 24
часов (для Pseudomonas aeruginosa);

- способности роста на питательном агаре при 4 °C в течение 24
часов (для Pseudomonas fluorescens) либо при температурном оптимуме, указанном
в паспорте.

Если культура не соответствует видовым свойствам, то она не
пригодна для дальнейшего использования.

 

10.5. Культивирование, хранение и контроль

эталонных культур бактериофагов

 

В качестве эталонного штамма для проведения контроля культуры
клеток хозяина при проведении анализа на колифаги используется РНК-содержащий
фаг MS2.

Процесс ведения эталонного штамма колифага MS2 состоит из 2
функциональных блоков:

- восстановление лиофилизированной культуры;

- создание запасов эталонной культуры и культуры для целевого
использования.

 

10.5.1. Восстановление лиофилизированной культуры

 

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированными культурами нагревают
над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к
нагретой части, в результате чего появляются трещины.

Конец ампулы накрывают трехслойной марлевой салфеткой, смоченной
70°-ным этиловым спиртом и хорошо отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в
течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла
погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~= 0,5 мл питательного бульона для
регидратации.

 

10.5.2. Создание запасов эталонной культуры фага

и культур для целевого использования

 

                                 +

    Рабочую культуру E.coli К12 F 
Str-r, хранящуюся на полужидком

агаре,  засевают 
в пробирку с 10 мл питательного бульона.  Посевы

инкубируют при (37 +/- 1)
°C 18 - 24 часа.

    После инкубации  0,1 мл
полученной бульонной культуры повторно

засевают в 3 - 4 пробирки с
10 мл питательного бульона и  помещают

в  термостат  при  (37 +/- 1) °C.  Через 2 часа инкубации в каждую

пробирку  вносят 
регидрированную  культуру  фага 
MS2,  инкубацию

продолжают до 18 - 24
часов.  После инкубации в пробирки
добавляют

по 1 мл хлороформа,
герметично укупоривают, интенсивно встряхивают

и оставляют на ночь в
холодильнике.

    Пипеткой отбирают бульон над осевшим хлороформом и переносят в

стерильные  пробирки, 
добавляют  по  1 мл хлороформа,  герметично

укупоривают, встряхивают и
хранят в холодильнике.

    Одну пробирку используют для целевого  назначения  в  контроле

                                        +

чувствительности культуры
E.coli  К12  F  Str-r  к 
фагу  согласно

п. 10.4.3. Две другие
служат запасом эталонного фага.

Активность полученной культуры определяется титром фага. Через
год хранения титр фага может снизиться. В этой связи необходимо получить новую
культуру или провести определение титра хранящегося фага.

 

10.5.3. Определение титра фага

 

Для определения титра фага выполняется серия десятикратных
разведений хранящейся бульонной суспензии эталонного фага, как описано в
разделе 9.

                                     +

    Бактериальную взвесь E.coli К12 F  Str-r готовят по 
стандарту

мутности,  как 
указано  в  разделе 
9,  вносят  в расплавленный и

остуженный до температуры
45 - 49 °C питательный агар из расчета 1

мл взвеси на 100 мл агара.

    По 1  мл  каждого 
разведения  эталонного  фага вносят в чашки

Петри  и 
заливают  приготовленной  смесью 
питательного  агара  и

            +

E.coli К12 F 
Str-r. Посевы 
инкубируют  при  37 
°C 18 - 24 часа.

Пробирки с разведениями
закупоривают резиновыми  или  силиконовыми

пробками  и 
хранят до получения результатов при температуре 4 - 8

°C.

    После инкубации 
просчитывают  количество  бляшек 
на  чашках.

Учету  подлежат 
чашки,  на  которых 
отмечается  рост  30 
-  100

негативных колоний фага.

                                                               7

    Для использования 
допускается  культура  с титром более 10  -

  8

10 .

                                   7

    При получении 
титра  менее  10  
фаг  можно  размножить. 
Для

нарастания титра необходимо
повторить описанную процедуру.

После выполнения работ с культурами фагов необходимо провести
тщательную обработку помещения дезсредствами и обеззараживания ультрафиолетовым
излучением.

Раздел составлен на основе:

бактериологического контроля питательных сред. Методические
рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц.
Хабаровск, 1979;

Методических рекомендаций к контролю питательных сред по
биологическим показателям. М., 1980;

ФС 42-3588-98. Питательная среда для выделения сальмонелл сухая
(висмут-сульфит агар), срок действия до 15.10.03;

сборника инструкций по общим методам контроля стерильности,
физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов
и токсичности медицинских иммунобиологических препаратов. Утв. Приказом МЗ СССР
N 31 от 13.01.83;

Руководства по аккредитации для лабораторий, производящих
микробиологическое тестирование;

ISO 10705-1:1995
"Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1:
Enumeration of F-specific RNA bacteriophages";

ISO 10705-1:1995
"Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 2:
Enumeration of somatic bacteriophages".

 

11. КОНТРОЛЬ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

 

Качество питательных сред является одним из важнейших факторов,
влияющих на достоверность результата анализа. Жесткая регламентация
приготовления питательных сред и выполнения комплекса процедур внутреннего
контроля качества является неотъемлемой частью обеспечения достоверности, а
также воспроизводимости и повторяемости результатов количественных
микробиологических анализов.

На конечный результат качества готовой питательной среды может
оказать влияние множество различных моментов. Поэтому контроль качества
питательных сред должен осуществляться на всех этапах технологического
процесса, начиная от момента закупки среды до непосредственного использования в
анализе, и включать следующие этапы:

1. Проверку документации и визуальный контроль питательных сред
при их получении.

2. Контроль условий и сроков хранения питательных сред.

3. Контроль питательных сред на этапе приготовления.

4. Контроль биологических свойств питательных сред.

5. Контроль на этапе использования питательных сред.

Данный раздел регламентирует процедуры внутреннего контроля
качества питательных сред, которые используются для выполнения текущего
производственного и государственного санитарно-эпидемиологического контроля
воды по санитарно-микробиологическим индикаторным показателям. Применение
питательных сред без подтверждения их качества не допускается. Результаты
выполнения процедур контроля качества должны быть документально зафиксированы.

 

11.1. Проверка документации и визуальный контроль

питательных сред

 

Данный этап контроля позволяет избежать покупки продукции у фирм,
не имеющих надлежащих документов, удостоверяющих и гарантирующих ее качество, а
также выявить грубые нарушения, возникшие при транспортировании
(разгерметизация упаковки, несоответствие внешнего вида обезвоженной среды или
отдельных компонентов описанию изготовителя и др.). Контроль осуществляют при
каждом поступлении в лабораторию новых сред.

При первом контакте с фирмой, производящей и (или) реализующей
питательные среды, необходимо затребовать копии лицензии на право производства
и реализации данных питательных ср