8 °C;

- восполнение запаса рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования;

- контроль видовых и паспортных свойств.

Хранение запаса рабочей культуры в полужидком агаре при 4 - 8 °C
не требует специального оснащения, но порождает необходимость восполнения
запасов рабочей культуры путем получения ее субкультур на среде хранения каждые
3 месяца.

Дополнительные пассажи через питательные среды могут привести к
диссоциации штамма и потере тестовых свойств. Восполнять запас рабочей культуры
разрешается только 3 раза (конец 3, 6 и 9 месяца) с момента его создания. Это
ограничивает срок использования эталонной культуры, полученной из 1 ампулы, 1
годом, по истечении которого необходимо вскрыть новую ампулу с тестовой
культурой.

Данный вариант культивирования и хранения эталонных культур
аэробов и факультативных анаэробов отражен на схеме в прилож. 7.1 <*>.

   
--------------------------------

<*> Не приводится.

 

10.2.1. Восстановление лиофилизированной

эталонной культуры

 

Оттянутый конец ампулы с лиофилизированной культурой нагревают
над пламенем горелки. Влажным концом стерильного ватного тампона прикасаются к
нагретой части, в результате чего появляются трещины. Конец ампулы накрывают
трехслойной марлевой салфеткой, смоченной 70°-ным этиловым спиртом и хорошо
отжатой, и обламывают пинцетом.

После вскрытия ампула остается накрытой той же салфеткой в
течение 1 - 2 мин. Затем салфетку осторожно снимают и вместе с остатками стекла
погружают в дезраствор. В ампулу вносят ~= 0,3 мл питательного бульона для
регидратации. Содержимое ампулы перемешивают, переносят стерильной пастеровской
пипеткой или шприцем в пробирку с питательным бульоном и инкубируют при 37 °C в
течение 18 - 24 часов. Оставшуюся бульонную культуру Е.coli M17-02 используют
для оценки степени диссоциации эталонного штамма.

    После инкубации из питательного бульона делают высев петлей на

скошенный  питательный 
агар  в  две пробирки.  При
восстановлении

                     +

штамма  E.coli 
К12 F  Str-r  посев 
осуществляется  на  скошенный

питательный агар,  содержащий стрептомицин.  Посевы инкубируют при

37 °C 18 - 24 часа.

Одну пробирку с посевом используют для постановки тестов на
соответствие полученного штамма видовым паспортным свойствам. Второй посев на
скошенном питательном агаре используют для создания запасов рабочей культуры.

Культура с измененными свойствами в работу не допускается.

 

10.2.2. Создание запасов рабочей культуры

 

    При удовлетворительном прохождении контрольных тестов культуру

                                                      +

со  скошенного 
питательного  агара  (для Е.coli К12 F   Str-r - с

питательного агара со стрептомицином)
засевают уколом в столбик  с

полужидким   агаром.  
В   зависимости   от 
интенсивности  работы

лаборатории посев проводят
в 4 - 7 пробирок из расчета по  1  -  2

пробирки  на 1 месяц работы и в 1 пробирку для
восполнения запасов

рабочей культуры через три
месяца  на  следующий  квартал.  Посевы

инкубируют  18 
-  24  часа при 37 °C.  При
наличии роста пробирки

закрывают  резиновыми 
пробками  и  закладывают 
на  хранение  при

температуре 4 - 8 °C.

Одну из пробирок с культурой, предназначенной для восполнения
рабочих запасов, маркируют и хранят отдельно. Запасы рабочей культуры
желательно хранить в отдельном холодильнике.

 

10.2.3. Восполнение запасов рабочей культуры

 

Восполнение запасов рабочей культуры производится в конце
третьего, шестого и девятого месяца с момента вскрытия ампулы (каждые 3
месяца).

Для восполнения запасов рабочей культуры используется субкультура
на среде хранения, полученная ранее при создании запасов или при очередном их
восполнении. Из пробирки с культурой, предназначенной для восполнения запасов,
производят посев в питательный бульон. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18
- 24 часов. Оставшуюся бульонную культуру Е.coli M17-02 используют для оценки
степени диссоциации.

    После инкубации из питательного бульона делают высев
петлей  в

две  пробирки со скошенным питательным
агаром.  При ведении штамма

            +

E.coli К12 F  Str-r посев осуществляется на скошенный  питательный

агар, содержащий
стрептомицин. Посевы инкубируют при 37 °C 18 - 24

часа.

Один из посевов используют для постановки тестов на соответствие
полученного штамма видовым паспортным свойствам. Второй посев на скошенном
питательном агаре используют для восполнения запасов рабочей культуры.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов процедура
закладки культуры на хранение осуществляется согласно п. 10.2.2. Восполнение
запасов рабочей культуры проводят только 3 раза. По истечении года
использования необходимо получить новую эталонную культуру из коллекции
микроорганизмов.

 

10.2.4. Подготовка культуры для целевого

использования в анализе

 

    Накануне использования 
культуру  с полужидкого агара
высевают

                                                           +

на 2 пробирки со скошенным
питательным агаром. E.coli К12 F  Str-r

пересевают на скошенный
питательный агар, содержащий стрептомицин.

Посевы инкубируют 18 - 24
часа при 37 °C.

Культуру из одной пробирки используют по назначению с
предварительной подготовкой согласно методическим документам. Вторая пробирка
используется для получения культуры для работы на следующий (второй) день. При
необходимости получения культуры тест-штамма на третий день высев снова
производят с полужидкого агара.

 

10.3. Оптимальный вариант ведения

эталонных культур

 

Процесс ведения штаммов в данном варианте состоит из следующих
блоков:

- восстановление и контроль лиофилизированной культуры;

- создание запаса эталонной культуры, хранение в условиях
криоконсервации;

- создание запаса рабочей культуры;

- подготовка культуры для целевого использования;

- контроль видовых и паспортных свойств.

Данный вариант ведения эталонных культур обеспечивает оптимальные
условия для накопления и длительного (3 - 5 лет) хранения эталонной культуры,
предназначенной для создания и регулярного восполнения запаса рабочей культуры.

В отличие от широко распространенной методики ведения культур
микроорганизмов, основанной на неограниченных последовательных (линейных)
пересевах, данная схема ведения сводит до минимума количество пассажей
эталонной культуры, проводимых от момента восстановления после лиофилизации до
целевого использования. Такой подход позволяет сократить вероятность
нежелательных мутаций, ведущих к потере эталонных свойств, или случайного
загрязнения. Забракованная линия эталонной культуры может быть в любой момент
заменена новой.

Графически оптимальный вариант культивирования и хранения
эталонных бактериальных культур аэробов и факультативных анаэробов отражен на
схеме и примерном календарном плане манипуляций в Прилож. 7.2, 7.3 <*>.

    --------------------------------

<*> Приложение 7.3 не приводится.

 

10.3.1. Восстановление и контроль

лиофилизированной культуры

 

Восстановление и контроль лиофилизированной культуры проводят,
как описано в п. 10.2.1.

 

10.3.2. Создание запасов эталонной культуры

 

Параллельно с постановкой контрольных тестов из пробирки со
скошенным питательным агаром культуру засевают в 2 пробирки с питательным
бульоном и инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C.

При удовлетворительном прохождении контрольных тестов, в пробирки
с ночной культурой добавляют стерильный глицерин в количестве 1/10 от объема
культуры. Содержимое тщательно перемешивают и вносят по 1 мл в промаркированные
пластиковые криопробирки из расчета 4 - 5 пробирок на каждый планируемый год
хранения. Криопробирки с запасом эталонной культуры устанавливают в криобокс
(штатив для криопробирок) и закладывают на хранение при температуре (70 +/- 10)
°C. Альтернативным вариантом является хранение в жидком азоте при наличии
соответствующего оборудования.

Закладку запасов эталонной культуры на длительное хранение осуществляют
единожды на весь период ее использования. Запасы эталонной культуры восполнению
не подлежат.

Данный блок выполняет задачу накопителя биомассы эталонного
штамма, что позволяет избежать необходимости восполнять запасы рабочей культуры
за счет повторных пассажей эталонного штамма через питательные среды и удлиняет
"срок службы" культуры, полученной из одной ампулы.

 

10.3.3. Создание запасов рабочей культуры

 

    Температуру криопробирки из запасов эталонной культуры доводят

до  комнатной 
температуры.  Содержимое  аккуратно  
перемешивают,

вносят  в 
пробирку  с 8 - 10 мл
питательного бульона и инкубируют

при 37 °C 18 - 20
часов.  После инкубации из
питательного  бульона

выполняют  высев 
в  две пробирки со скошенным
питательным агаром.

                   +

Для  E.coli 
К12  F   Str-r  -  на 
питательный  агар,  содержащий

стрептомицин. Посевы
инкубируют в термостате (18 - 24) часа при 37

°C.  Оставшуюся бульонную культуру E.coli  M17-02 
используют  для

оценки степени диссоциации,
как указано в пункте 10.4.1.

Один из посевов на скошенном питательном агаре используют для
постановки тестов на соответствие полученного штамма паспортным (типовым)
свойствам. Второй посев используют для создания запасов рабочей культуры.

При несоответствии штамма видовым и паспортным свойствам
использование культуры не допускается. В этом случае необходимо разморозить еще
одну емкость с эталонной культурой и подвергнуть ее аналогичному исследованию.

Если культура снова не прошла контроль, ее снимают с хранения и в
дальнейшем не используют. Необходимо получить новую ампулу с эталонной
культурой и начать процедуру ведения тестового штамма сначала.

При удовлетворительном прохождении тестов культуру из пробирки со
скошенным питательным агаром засевают уколом в 3 - 6 пробирок с полужидким
агаром из расчета 1 - 2 пробирки на месяц в зависимости от интенсивности работы
лаборатории. Посев инкубируют 18 - 24 часа при 37 °C. Пробирки закрывают
резиновыми или силиконовыми пробками и хранят при 4 - 8 °C.

Запасы рабочей культуры создают 1 раз в 3 месяца, используя для
этой цели новую пробирку из запаса эталонной культуры. Повторное замораживание
размороженной эталонной культуры запрещается. Запасы рабочей культуры
желательно хранить в отдельном холодильнике.

 

10.3.4. Подготовка культуры для целевого
использования

 

Подготовку культуры для целевого использования осуществляют, как
описано в п. 10.2.4.

 

10.4. Контроль эталонных бактериальных культур

 

Постановка контроля включает:

- оценку степени диссоциации культуры Е.coli M17-02;

- проверку видовых свойств бактериальных культур;

                                             +

    - проверку   
способности   E.coli  К12 F 
Str-r  лизироваться

специфичным фагом MS2;

                                      +

    - проверку 
культуры  E.coli К12 F  Str-r 
на  однородность  и

отсутствие загрязнения
фагом.

 

10.4.1. Оценка степени диссоциации

культуры E.coli. M17-02

 

Из 18-часовой бульонной культуры делают 10-кратные разведения
физиологическим раствором. По 0,1 мл из 5 и 6 разведения засевают на 2 чашки питательного
агара, предварительно подсушенные в термостате. Шпателем посевы распределяют по
поверхности агара до полного исчезновения влаги и инкубируют в термостате при
температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов.

Выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 100 колоний. Проверку
тест-штаммов на диссоциацию производят путем визуального просмотра
изолированных колоний на чашках в прямом и косонаправленном свете через
бинокулярную лупу или микроскоп на малом увеличении.

На питательном агаре колонии бактерий вида Е.coli образуют
колонии средней величины (3 - 5 мм), плоско-выпуклые, круглые, гладкие с ровным
краем (S-форма), влажные, блестящие, прозрачные в прямом и непрозрачные
(опалово-мутные) в косопроходящем свете. В косопроходящем свете колонии эшерихий
могут иметь равномерную зернистость.

В R-форме колонии эшерихий более плоские, большего размера,
неправильной формы с неровными краями и шероховатой матовой поверхностью.

При наличии диссоциации (по размеру, S-R-диссоциация, др.)
подсчитывают количество измененных колоний и общее количество просмотренных
колоний. Общее количество просмотренных бактерий не должно быть менее 30. Затем
рассчитывают процент диссоциации по формуле:

 

                               количество

                           измененных колоний

           % диссоцации = --------------------- x 100%.

                            общее количество