т путем прикладывания pH-индикаторной бумаги к
поверхности вымытого мокрого стекла, прошедшего обработку. Для контроля
произвольно выбирают 3 - 10 ед. посуды. Значение pH воды, полученной в
результате контроля, должно соответствовать pH дистиллированной воды,
примененной для ополаскивания.

Наличие остаточных жировых загрязнений может быть определено с
помощью реактива, содержащего Судан III. Для этого внутреннюю поверхность
вымытой и высушенной посуды смачивают 3 - 5 мл красящего раствора, распределяют
его по исследуемой поверхности в течение 10 с, затем быстро смывают обильной
струей воды. На внутренней поверхности посуды не должно оставаться желтых пятен
и подтеков.

Приготовление красящего раствора: в 70 мл нагретого до 60 °C
90%-ного этилового спирта растворяют по 0,2 г измельченной краски Судан III и
метилового синего, затем добавляют 10 мл 20 - 25%-ного раствора аммиака, 20 мл
дистиллированной воды и взбалтывают. Раствор годен в течение 6 месяцев.

Методика проверки качества промывки лабораторной посуды от моющих
средств и подбора режима мытья посуды при использовании нового моющего
средства, рекомендованная ИСО 9998:1991 (E), приведена в Прилож. 12 в качестве
справочной информации.

 

Подготовка посуды к использованию

 

Лабораторную посуду (флаконы, пробирки, бутылки, колбы) закрывают
силиконовыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный (из
фольги) колпачок. Бумажный колпачок обвязывают вокруг горлышка ниткой или
закрепляют резиновым кольцом.

Чашки Петри, пипетки стерилизуют завернутыми в плотную оберточную
бумагу или в пеналах.

При использовании специальной лабораторной посуды и расходных
материалов (флаконов с завинчивающимися пробками, металлических или силиконовых
колпачков, выдерживающих автоклавирование, микробиологических пробок
многоразового использования и других материалов) следует руководствоваться
рекомендациями производителя.

Стерилизацию лабораторной посуды осуществляют сухим жаром в
сушильном шкафу при 160 °C - в течение 2 часов, 180 °C - в течение 60 мин. или
паром в автоклаве при 1 атм., 121 °C - в течение 30 мин. с последующим
подсушиванием в сушильном шкафу при отсутствии вакуумной сушки в автоклаве.

После стерилизации посуду хранят до использования в закрытом
шкафу или ящиках с крышками не более 10 суток при ненарушенной упаковке или
невскрытом пенале.

Пробирки и другую лабораторную посуду до стерилизации следует
хранить в чистых коробках или ящиках столов, выложенных чистой фильтровальной
бумагой. Сверху подготовленную посуду также следует прикрыть фильтровальной
бумагой от пыли и случайной грязи.

Вымытые предметные стекла вытирают чистой салфеткой и помещают в
склянку с притертой пробкой со смесью Никифорова (смесь этилового спирта и
эфира в соотношении 1:1).

 

Обработка резиновых пробок

 

Новые пробки кипятят 30 мин. в 2%-ном растворе бикарбоната
натрия, многократно промывают горячей проточной водопроводной водой (кипячение
и промывание повторяют дважды). Затем пробки кипятят 30 мин. в дистиллированной
воде, промывают и высушивают.

Пробки, бывшие в употреблении, после кипячения в 2%-ном растворе
бикарбоната натрия ополаскивают проточной водопроводной водой, кипятят 30 мин.
в дистиллированной воде, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают.

Резиновые пробки для флаконов заворачивают в бумагу или фольгу и
стерилизуют автоклавированием.

Раздел составлен на основании:

СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III -
IV групп патогенности и гельминтами";

МУК 4.2.577-96 "Методы микробиологического контроля
продуктов детского питания и лечебного, их компонентов";

Инструкции по микробиологическому контролю производства на
предприятиях молочной промышленности, 1987;

ОСТа 42-21-2-85 "Стерилизация и дезинфекция изделий
медицинского назначения. Методы, средства и режимы". МЗ, 1985;

Приказа МЗ РФ N 309 "Об утверждении Инструкции по
санитарному режиму аптечных организаций (аптек)";

XI Государственной фармакопей СССР. Вып. 2, 1990.

 

9. ПРАВИЛА ПРИГОТОВЛЕНИЯ СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ

 

Разведением для микробиологических исследований служит раствор
или суспензия исследуемого образца, смешанные с девятикратным количеством
жидкости для разведения - разбавителем.

Приготовление разведений необходимо:

- при исследовании загрязненных вод в целях снижения количества
микроорганизмов на единицу объема, для обеспечения возможности наблюдения за их
ростом или подсчетом колоний;

- для постановки исследований, требующих количественного учета
используемых модельных микроорганизмов, например при количественной оценке
качества питательных сред, мембранных фильтров и т.д.

Приемлемое для учета число микроорганизмов составляет:

- для метода подсчета колоний на чашках Петри (90 - 100 мм) - от
15 до 300;

- для учета колоний на фильтре (47 - 50 мм) - от 15 до 100
колоний;

- для учета колоний на фильтре (35 мм) - от 15 до 60 колоний.

Важным моментом в процедуре приготовления разведений является
равномерность распределения внесенных микроорганизмов по объему разбавителя.
Равномерность распределения достигается тщательным перемешиванием полученной
смеси. Достичь более качественных результатов позволяет использование
специальных приборов - встряхивателей.

В процессе приготовления разведений каждый образец с помощью
прибора тщательно взбалтывают в течение 5 - 10 с. Частоту вращения подбирают
так, чтобы жидкость, которая образует воронку, не доходила до края пробирки на
2 - 3 см.

 

Разбавители

 

В качестве разбавителей при приготовлении разведений используют:

    Пептонно-солевой разбавитель

    Пептон                                                   1,0 г

    Натрий хлористый                                         8,5 г

    Дистиллированная вода                                  1000 мл

    Физиологический раствор

    Натрий хлористый                                         8,5 г

    Дистиллированная вода                                 1000 мл.

Для приготовления разбавителя указанные компоненты растворяют в
воде, при необходимости с подогреванием. Доводят pH так, чтобы после
стерилизации он был равен 7,0 +/- 0,2 при 25 °C. Разливают разбавитель во
флаконы. Стерилизуют при 121 °C в течение 20 мин. Помимо перечисленных выше
разбавителей, для приготовления разведений исследуемой воды допускается
применение стерильной водопроводной воды.

 

Методика выполнения разведений исследуемой воды

 

Разведения исследуемого образца воды следует готовить
непосредственно перед анализом и использовать для инокуляции не позже 30 мин. с
момента приготовления. В стерильные пробирки, количество которых соответствует
выбранной степени разбавления исследуемой воды, асептически вносят по 9 мл
разбавителя. В первую из пробирок, содержащих 9 мл разбавителя, не касаясь
стенок пробирки и поверхности разбавителя, пипеткой вносят 1 мл хорошо
перемешанной пробы воды, тщательно встряхивают или перемешивают пипетированием.

                                          -1

    Приготовленное первое  
разведение (10  )  содержит  
в  1  мл

суспензии 0,1 мл исходного
образца. В следующую (вторую) пробирку,

также  содержащую 
9 мл разбавителя,  не касаясь
стенок пробирки и

поверхности  разбавителя,  новой  пипеткой  вносят 
1  мл   хорошо

перемешанного   первого  
разведения   исследуемой   пробы. 
Смесь

тщательно  встряхивают 
или  перемешивают  пипетированием.  Второе

               -2

разведение  (10 
)  в  1  мл  суспензии содержит 0,01 мл исходного

образца.

Процедуру приготовления разведений продолжают по описанной схеме
до получения суспензии с необходимой концентрацией исходного образца.

 

Методика приготовления суспензий с заданной

концентрацией клеток тестовых микроорганизмов

 

Приготовление суспензий с заданной концентрацией клеток тестовых
микроорганизмов осуществляют с использованием оптического стандарта мутности,
соответствующего 0,9 - 1 млрд. микробных клеток/мл.

В стерильную стандартную пробирку, прилагаемую к стандарту,
вносят 3 - 4 мл разбавителя. Агаровую культуру тестового микроорганизма петлей
переносят в пробирку и растирают по внутренней поверхности пробирки, постепенно
смешивая с содержащимся в ней разбавителем.

Возможно приготовление бактериальной взвеси методом смыва
выросшей культуры со скошенного агара 5 мл разбавителя.

Полученную взвесь микроорганизмов интенсивно встряхивают,
добиваясь полного и равномерного распределения клеток. Мутность полученной
взвеси сравнивают с мутностью оптического стандарта, который также
предварительно тщательно встряхивают.

При визуальном несоответствии мутности приготовленной суспензии
стандарту ее доводят либо добавлением агаровой культуры, либо добавлением
разбавителя. После каждого вносимого изменения суспензию тщательно встряхивают.

    При совпадении 
мутности  приготовленной  суспензии и мутности

оптического стандарта
считается,  что концентрация клеток
тестовой

культуры  в 
данной  суспензии  примерно 
соответствует  значению,

                                              9

указанному для данного
стандарта (0,9 - 1 x 10  кл/мл).

Для получения суспензии с нужной концентрацией тестового
микроорганизма выполняют серийные разведения полученной стандартной суспензии
описанным выше способом.

Для контроля правильности приготовления суспензии, правильности
выполнения разведений и расчета заражающей дозы проводят контрольный высев.
Выполнение контроля разведений и расчета заражающей дозы описаны в разделе
11.4.2.1.

Раздел составлен на основе:

ISO 6887-1983 "Общее руководство по приготовлению разведений
для микробиологических исследований".

 

10. ПРОЦЕДУРА ВЕДЕНИЯ ЭТАЛОННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
КУЛЬТУР

 

10.1. Общие положения

 

Ведение эталонных культур обеспечивает максимальное сохранение
типовых свойств штаммов, что достигается соблюдением принципов их
культивирования, контроля и хранения.

Основные принципы ведения эталонных бактериальных культур:

- эталонные штаммы следует получать из официально признанной
коллекции микроорганизмов;

- количество пассажей тестового микроорганизма на питательных
средах с момента его восстановления до момента его целевого использования
должно быть, по возможности, минимальным;

- движение культуры с момента ее восстановления после
лиофилизации до целевого использования должно быть однонаправленным, т.е.
запасы эталонной культуры не должны пополняться за счет (из) запасов рабочей
культуры. Нежелательно пополнять запасы рабочей культуры путем получения ее
субкультур;

- контроль эталонного штамма на соответствие паспортным данным и
отсутствие диссоциации необходимо проводить перед закладкой на длительное
хранение и перед восполнением запасов рабочей культуры;

- штаммы с измененными свойствами для дальнейшей работы не
используют;

- для целевого использования пригодны культуры эталонного штамма,
прошедшие с момента высева со среды для хранения запасов рабочей культуры не
более 2 пассажей.

Данный раздел регламентирует вопросы культивирования, хранения и
контроля эталонных культур, которые должны использоваться для обеспечения
надлежащего качества исследований в практике лабораторий, выполняющих
санитарно-микробиологические исследования воды.

Согласно СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", пункт 3.1.6:
"Производственным подразделениям предприятий, контролирующим готовую
продукцию, разрешается иметь только коллекцию типовых культур, предусмотренных
нормативно-технической документацией".

В практике лабораторий, выполняющих санитарно-микробиологические
исследования воды, используются следующие эталонные культуры микроорганизмов:

1. E.coli M17-02 как положительный контроль биохимических тестов
и отрицательный контроль реактива на оксидазу; для контроля мембранных
фильтров; для контроля качества питательных сред по биологическим показателям.

2. Pseudomonas aeruginosa или Pseudomonas fluorescens как
положительный контроль реактива на оксидазу.

                   +

    3. E.coli К12 F  Str-r
для выполнения анализа на колифаги.

    4. Фаг MS2 для контроля способности  рабочей  культуры  E.coli

     +

К12 F  Str-r лизироваться специфическим фагом.

Хранение культур осуществляется в соответствии с п. 3.2.12 СП
1.2.036-95. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами
III - IV групп патогенности.

С учетом различной технической и материальной обеспеченности
лабораторий возможны два варианта ведения эталонных бактериальных культур:

- без создания запаса эталонной культуры длительного хранения, не
требующий специального оснащения;

- с созданием запаса эталонной культуры длительного хранения с
применением криоконсервации, который следует рассматривать как оптимальный.

 

10.2. Ведение эталонных бактериальных

культур без создания запаса эталонной культуры

длительного хранения

 

Процесс ведения эталонных культур в данном варианте состоит из следующих
блоков:

- восстановление и контроль лиофилизированной культуры;

- создание запаса рабочей культуры; хранение в полужидком агаре
при 4 -