осят
мембранный фильтр с основания на чашку со средой. Между мембранным фильтром и
поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха. Чашки с посевами
переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2)
часов.

Рост микроорганизмов свидетельствует о неэффективной обработке
фильтровальной установки. Результаты заносят в журнал контроля стерильности
фильтровальных установок и визируют подписью сотрудника, выполнившего контроль
(Прилож. 6). Обо всех случаях нестерильности фильтровальных установок ставят в
известность руководителя подразделения.

 

6.6. Процедура контроля обсемененности флаконов

для отбора проб

 

Контролю подвергаются все виды флаконов, используемые для отбора
проб: стеклянные, многоразового использования после стерилизации и пластиковые
одноразового использования, поступающие стерильными от производителя.

Условия проведения испытаний в значительной мере обусловливают
качество данного вида контроля. В этой связи его неотъемлемой частью является
следующий комплекс мероприятий.

1. Анализ проводят в боксе для разливки сред или в посевных комнатах
(боксах) для посева питьевой воды.

2. Непосредственно перед исследованием проводят дезинфекционную
обработку помещения (мытье бокса). После дезобработки включают дополнительно
бактерицидные лампы на 1,5 - 2 часа.

Спецодежду для проведения анализа (халат, шапочку, четырехслойную
марлевую маску) стерилизуют. Режим стерилизации спецодежды: автоклавирование
при температуре (120 +/- 1) °C в течение 45 минут или при температуре (132 +/-
2) °C в течение 20 минут.

Перед входом в бокс сотрудник, проводящий испытания, тщательно
моет руки теплой водой с мылом и щеткой, вытирает стерильным полотенцем,
одевается в стерильный халат, шапочку, маску, надевает перчатки, обрабатывает
их 70%-ным этиловым спиртом.

При наличии ламинарного укрытия исследование выполняют в
спецодежде с использованием стерильных перчаток.

Во время испытаний проводят контроль воздуха на обсемененность в
соответствии с процедурой, описанной в п. 6.2. Результаты контроля заносят в
протокол испытания.

 

Контроль обсемененности стеклянных

флаконов для отбора проб

 

Целью проведения данного вида контроля является выборочный
контроль качества подготовки посуды в отношении различных по устойчивости
микроорганизмов, учитываемых при проведении анализа питьевой воды: контроль на
общую обсемененность, контроль на наличие спор сульфитредуцирующих клостридий.

При проведении контроля режимов суховоздушной стерилизации в
полном объеме (биологический, термический, химический) с рекомендуемой
периодичностью контроль обсемененности стеклянных флаконов для отбора проб в
зависимости от объема стерилизуемых партий проводят не реже 1 раз в квартал.

Для каждого вида анализа отбирают флаконы в количестве 1%, но не
менее 3 от общего количества партии стерилизованной посуды. Партией флаконов
считают все флаконы, прошедшие стерилизацию за один цикл работы одного
стерилизатора.

В случае получения результата, свидетельствующего о
нестерильности хотя бы одного флакона, все партии флаконов, прошедшие обработку
в данном стерилизаторе, бракуют. Забракованные партии флаконов подлежат
повторной стерилизации. Выясняют возможные причины нарушения стерильности.
Проводят комплексную проверку стерилизатора с одновременным использованием
химического, термического (в 5 точках) и биологического контроля согласно п.
6.1.

 

Подготовительный этап

 

Для контроля используют:

- жидкую полноценную неселективную среду (питательный бульон,
ГРМ-бульон и др.) проверенной ранее серии (раздел 11);

- плотную полноценную неселективную среду (питательный агар,
ГРМ-агар и др.) проверенной ранее серии (раздел 11);

- железосульфитный агар, приготовленный согласно МУК 4.2.1018-01,
либо зарубежные аналоги, предназначенные для определения сульфитредуцирующих
клостридий в воде;

- стерильные мембранные фильтры (нитрат- или ацетат-целлюлозные)
для микробиологических целей с диаметром пор 0,45 мкм проверенной ранее партии
(раздел 12);

- стерильные чашки Петри диаметром 90 мм;

- стерильную водопроводную воду;

- спирт-ректификат 96°-ный для фламбирования;

- спирт-ректификат 70%-ный для дезинфекции.

Питательный бульон предварительно проверяют на стерильность. Для
этого 2 пробирки от приготовленной партии среды инкубируют при температуре 37
°C в течение 48 часов - учитывают наличие (отсутствие) пророста среды. При
наличии пророста партию бульона выбраковывают. Контроль стерильности
питательного агара и железосульфитного агара проводят в процессе исследования
путем постановки отрицательного контроля.

 

Методика контроля

 

Контроль на общую обсемененность

В исследуемые флаконы вносят питательный бульон в количестве 20%
от объема флакона (например, во флакон 500 мл вносят 100 мл питательного
бульона). Флаконы закрывают стерильными резиновыми (силиконовыми) пробками.

Переворачиванием или встряхиванием флаконов трехкратно обмывают
всю внутреннюю поверхность флакона, включая пробку. Инкубацию посевов проводят
в этих же флаконах при (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 2) часа. При видимом
росте (помутнение бульона) в каком-либо флаконе результат учитывают как
"не стерильно". При сохранении прозрачности питательного бульона
проводят контроль пророста бульона: из каждого флакона отбирают по 1 мл
содержимого, вносят в 2 стерильные чашки Петри и заливают питательным агаром.
Параллельно для контроля стерильности используемого питательного агара
стерильную чашку Петри заливают тем же питательным агаром (отрицательный
контроль). Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °C в течение 48
часов.

Наличие бактериального роста при условии отсутствия роста
микроорганизмов в отрицательном контроле свидетельствует о нестерильности
флакона. Результаты заносятся в протокол исследования.

Контроль на наличие спор сульфитредуцирующих клостридий

В исследуемые флаконы вносят стерильную водопроводную воду в
количестве 20% от объема флакона (например, во флакон 500 мл вносят 100 мл
воды). Флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками.

Переворачиванием или встряхиванием флаконов трехкратно обмывают
(смачивают) всю внутреннюю поверхность флакона, включая пробку. Фильтровальную
установку фламбируют, после чего производят фильтрацию 100 мл стерильной
водопроводной воды (отрицательный контроль), затем через другой мембранный
фильтр без дополнительного обжига установки фильтруют весь объем смыва с
флакона.

Дальнейшие исследования обоих фильтров ("смыва" и
"контроля") выполняют аналогично по схеме анализа на выявление спор
сульфитредуцирующих клостридий по МУК 4.2.1018-01.

Наличие роста колоний сульфитредуцирующих клостридий при
отсутствии роста в отрицательном контроле свидетельствует о нестерильности
флакона. Результаты заносятся в протокол исследования.

Раздел составлен на основе:

МУ 24-92 Министерства медицинской промышленности "Контроль
стерильности материалов первичной упаковки".

 

7. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ ВОДЫ

 

В микробиологических исследованиях воды дистиллированная вода
используется для приготовления питательных сред, различных растворов, мытья
лабораторной посуды, заправки паровых стерилизаторов.

Дистиллированная вода, применяемая в микробиологических
лабораториях, должна соответствовать требованиям ГОСТа 6709-72 и проходить
контроль не реже 1 раза в месяц.

Хранить дистиллированную воду следует в стеклянных или
пластиковых бутылях, желательно с нижним сливом, закрытых крышками или
пробками.

Примечание. Документы Международного комитета по стандартизации
предъявляют более жесткие требования к воде, предназначенной для приготовления
питательных сред. Разный состав воды может обусловливать отличия по качеству
питательных сред, приготовленных в разных лабораториях или даже в одной и той
же лаборатории из обезвоженной среды одной серии одного производителя, и, как
следствие, существенные различия в результатах анализа.

 

В качестве оптимального варианта для приготовления питательных
сред, а также реактивов, используемых непосредственно в анализе, предлагается
применение бидистиллированной или деминерализованной воды.

Стандарт ISO 7218:1996, а также ГОСТ Р 51446-99 качество воды,
предназначенной для приготовления питательных сред, оценивают по удельному
сопротивлению, которое должно быть не менее 300000 Ом/см (либо по
электропроводности - не более 3 МкС/см).

Об этом необходимо помнить при использовании для приготовления
питательных сред дистиллированной воды, полученной с помощью дистилляторов и
контролируемой по ГОСТу 6709-72.

При использовании деминерализованной воды необходимо обращать
внимание на содержание микроорганизмов, которые могут размножаться на фильтрах
и при прохождении через ионообменник попадать в воду. При высокой контаминации
воды микроорганизмами продукты их жизнедеятельности могут оказывать
ингибирующее действие на рост исследуемых микроорганизмов. Наиболее адекватным
методом контроля в этих случаях является определение общего числа
микроорганизмов, выросших на питательном агаре при температуре 22 °C в течение
72 часов.

При приобретении установок деионизированной воды для
микробиологических анализов необходима консультация с производителями в целях
выбора способов обработки, предотвращающих вторичное микробное загрязнение
воды.

Раздел составлен на основе:

ГОСТа 6709-72 "Вода дистиллированная";

ГОСТа 51446-99 (ISO 7218-96) "Микробиология. Продукты
пищевые. Общие правила микробиологических исследований";

ISO 7218:1996 "Микробиология продуктов питания и кормов для
животных. Общие правила микробиологических исследований";

ISO 3696-87 "Вода для аналитических лабораторных
исследований. Спецификация и методы испытания";

ISO 9998:1991 (E) "Качество воды. Методы оценки и контроля
микробиологического подсчета колоний в средах с применением тестов качества
воды".

 

8. ТРЕБОВАНИЯ К ПОДГОТОВКЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ПОСУДЫ

 

Одним из факторов, оказывающих влияние на результаты проводимых
исследований воды, является недостаточная чистота посуды.

Вся лабораторная посуда, вышедшая после проведения исследования
(чашки, колбы, пробирки со средами), помещается в специальные биксы или ведра с
крышками и обеззараживается автоклавированием при 126 °C в течение 60 мин. или
132 °C в течение 20 мин. Категорически запрещается освобождать использованную
посуду от содержимого (питательных сред, растворов с посевами) до
обеззараживания.

В исключительных случаях допускается обеззараживание кипячением в
2%-ном растворе пищевой соды или 0,5%-ном растворе нейтрального моющего
средства в течение 60 мин. с момента закипания. Кипячение должно происходить в
закрытой емкости с полным погружением в раствор.

Отработанные пипетки обеззараживают в высоком сосуде с полным
погружением в дезраствор. Продолжительность обеззараживания зависит от
применяемого дезсредства.

При выборе методов обеззараживания необходимо руководствоваться
санитарными правилами СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с
микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". Допускаются
также к использованию новые дезинфекционные средства, получившие разрешение
Минздрава России на применение. В этих случаях следует руководствоваться
рекомендациями производителя.

Для мытья посуды необходимо применять нейтральные моющие
средства, лучше всего применять жидкое моющее средство "Прогресс".
Допустимо также использовать с этой целью нейтральные синтетические моющие
средства, не содержащие биодобавок (например, "Лотос", "Кристалл",
"Эра").

 

Схема мытья посуды для исследования воды

 

Для облегчения процесса мытья посуды после автоклавирования
обеззараженную посуду следует замочить в 1%-ном растворе моющего средства
"Прогресс" в горячей воде на 1 - 2 часа. Всю посуду тщательно промыть
с помощью ершей и щеток. Отполоснуть от моющего средства в проточной
водопроводной воде (8 - 10 раз при использовании моющего средства
"Прогресс" и до 15 раз при использовании других порошков).
Прополоскать в проточной дистиллированной воде 3 - 4 раза. Высушить при комнатной
температуре или в сушильном шкафу при температуре 80 - 100 °C.

Перед мытьем обеззараженных пипеток удаляют "ватики",
промывают водопроводной водой под давлением и кипятят в 1%-ном растворе
бикарбоната натрия в течение 45 мин., многократно промывают водопроводной,
затем дистиллированной водой. Высушивают, вставляют "ватики" и
стерилизуют в суховоздушном стерилизаторе в завернутом виде или пенале.

 

Обработка новой посуды

 

Новую посуду, предназначенную для бактериологических
исследований, моют в 0,5%-ном растворе моющего средства, ополаскивают проточной
водопроводной водой и кипятят в течение 15 - 20 мин. в 1 - 2%-ном растворе
соляной кислоты, затем ополаскивают дистиллированной водой.

 

Проверка качества мытья лабораторной посуды

 

При обработке и мытье стеклянной лабораторной посуды используются
моющие и дезинфицирующие средства, содержащие вещества, которые могут влиять на
рост микроорганизмов. Контроль на наличие остаточных количеств моющих средств
имеет важное значение.

Контроль чистоты мытья лабораторной посуды осуществляют путем
визуального наблюдения и выборочного проведения тестов.

Стекло вымытой и высушенной посуды должно быть прозрачным, без
подтеков, пятен и посторонних включений. При ополаскивании вымытой посуды вода
стекает равномерно со стенок флаконов, пробирок, по поверхности чашек и пр.

Качество удаления синтетических моющих и моюще-дезинфицирующих
средств оценивают по величине pH. Для этих целей используют pH-индикаторную
бумагу с шагом измерительного диапазона не более 0,3 ед. Предварительно
определяют pH воды, применяемой для ополаскивания посуды на конечном этапе.
Контрольные измерения pH проводя