g=EN-US>Evaluation of
membrane filters used for microbiological analyses").

 

13. ОСОБЕННОСТИ ПОСТАНОВКИ ТЕСТОВ

НА ЭТАПЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ

 

Идентификация должна проводиться только с чистой культурой.
Проведение биохимической идентификации штаммов, выделенных на селективной
питательной среде (Эндо или ее аналогах), предпочтительнее проводить с
субкультурой, полученной на одной из неселективных питательных сред, не
содержащих углеводов (ПА, ГРМ-агар, МПА). Постановка подтверждающих тестов
всегда должна сопровождаться постановкой положительных и отрицательных
контролей с эталонными культурами, ферментативная активность которых определена
ранее.

Минимальное количество колоний, необходимое для идентификации,
указано в нормативных документах на данный вид анализа.

Примечание (информационное). Достоверность количественного
результата повышается с увеличением числа идентифицированных колоний.

В частности, ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы
культивирования микроорганизмов" при необходимости подтверждения
характерных колоний требует отбирать не менее 5 изолированных колоний с
пересевом для дальнейшей идентификации на неселективную питательную среду.

Французским комитетом по стандартизации АФНОР установлены
следующие правила отбора достаточного количества колоний для подтверждения.

                                                              1

    Если принять,  что n -
количество типичных  колоний,  а 
n   -

необходимое количество
колоний для подтверждения, то:

                  1

    - при n < 5, n  = n;

                           1

    - при 5 <= n < 25, то n 
= 5;

                        1    
__

    - при n >= 25,  то
n  = \/ n (округленное до общего
наивысшего

количества).

 

13.1. Определение грам-принадлежности

 

Классический способ определения грам-принадлежности бактериальных
клеток окраской по Граму с последующей микроскопией можно заменить простым и
быстрым способом, не требующим оптики, - тестом Грегерсена.

Исследования проводят со свежими культурами. Бактериальную массу,
взятую с плотной среды, в течение нескольких секунд эмульгируют на предметном
стекле в капле 3%-ного водного раствора КОН. Образование слизи, тянущейся за
петлей, указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным
микроорганизмам. Грамположительные микроорганизмы в этой реакции слизь не
образуют.

 

13.2. Постановка оксидазного теста

 

Используют реактивы, рекомендованные в МУК 4.2.1018-01.
Предпочтительно пользоваться готовыми индикаторными системами, изготовленными
промышленным способом (например, СИБ-оксидазы, диски оксидазы производства
LACHEMA, MERCK, DIFCO).

Надежный результат оксидазного теста может быть получен только
при использовании суточной культуры, выращенной на неселективном питательном
агаре. Следует иметь в виду, что при постановке оксидазного теста путем
наложения мембранного фильтра с выросшими колониями на оксидазный реактив,
постановки реакции с колонией, выращенной на среде Эндо, типичные темно-красные
колонии могут давать нечеткую реакцию.

Каждый раз при постановке теста (серии тестов) проводят
контрольные испытания с тест-культурами микроорганизмов, дающих положительную
(Pseudomonas aeruginosa) и отрицательную (Е.coli) реакции.

Для постановки реакции используют пастеровскую пипетку или
проверенную бактериологическую петлю, не давшую ложных реакций в указанном
тесте при испытании с контрольными культурами.

 

Методика постановки

 

Исследуемую колонию пересевают на скошенный питательный агар.
Инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 часов. Оксидазный диск слегка
смачивают дистиллированной водой / пропитывают реактивом фильтровальную бумагу.
Делают мазок культуры на диске с реактивом. Появление окраски не позднее чем
через 10 секунд рассматривается как положительная реакция.

При использовании коммерческих тест-систем процедура определения
выполняется согласно инструкции.

 

13.3. Определение ферментации углеводов

 

Предпочтительно исследовать 18 - 24-часовую субкультуру,
полученную на питательном агаре. Для контроля используются жидкие или
полужидкие среды, проверенные ранее, как указано в разделе 11. Посев
исследуемого штамма осуществляют в среды с углеводами по общепринятым
методикам. Постановка положительного и отрицательного контроля осуществляется,
как указано в пункте 11.5.3. Инкубацию посевов проводят согласно методической
документации.

Оценку результатов проводят по окончании срока инкубации путем сравнения
изменений в исследуемом посеве с изменениями в положительном контроле.
Обязательным условием является отсутствие изменений отрицательного контроля.

Раздел составлен на основе:

ГОСТа 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования
микроорганизмов";

стандарта АФНОР NF Т 90-416, 1985;

Методических рекомендаций "Обнаружение и идентификация
Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде,
сточных жидкостях)": МЗ СССР. М., 1984;

ГОСТа 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического
анализа". М., 1973;

XI Государственной фармакопеи СССР. М., 1998; ИСО 7218-96;

Инструкции к ОКСИ-тест(у), ЛАХЕМА, Чешская Республика;

Определителя бактерий Берджи / Под ред. Дж Хоулта, Н. Кинга, П.
Спита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. М.: "Мир", 1997.

 

БИБЛИОГРАФИЯ

 

1. Бактериологический контроль питательных сред. Методические
рекомендации в помощь бактериологам санитарно-эпидемических станций и больниц.
Хабаровск: МЗ РСФСР, 1979.

2. Методические указания по бактериологическому контролю качества
проведения противоэпидемических мероприятий в акушерских стационарах. Прилож. 4
к Приказу Комитета здравоохранения г. Москвы и ЦГСЭН в г. Москве N 617/6 от
19.11.98.

3. Руководство по аккредитации для лабораторий, проводящих
микробиологическое тестирование. Европейская кооперация по аккредитации
лабораторий (EAL), 1996.

4. Руководство по контролю качества питьевой воды. Т. 1. ВОЗ.
Женева, 1994.

5. Методы для унификации санитарно-микробиологических
исследований воды / Сборник СЭВ: Бад Эльстер, 1979.

6. Унифицированные санитарно-микробиологические методы
исследований воды в странах - членах СЭВ / Сборник СЭВ. М., 1988.

7. Council
directive 98/93/EC of 3 November 1998 on the quality of water intended for
human consumption. Official Journal of the European Communities. 5.12.98
(Директива Совета Европейского Союза 98/83/ЕС по качеству воды, предназначенной
для потребления человеком).

8. Guidelines
for drinking-water quality. V. 2. WHO. Geneva, 1996.

9. ISO 3696-87 "Вода для аналитических лабораторных исследований.
Спецификация и методы испытания".

10. ISO
8402:1994 (E/F/R). Управление качеством и обеспечение качества. 2-ое
изд./ Словарь.

11. ISO 6887-1983 "Общее руководство по приготовлению
разведений для микробиологических исследований".

12. ISO 7218:1996 " Микробиология продуктов питания и кормов
для животных. Общие правила микробиологических исследований".

13. ISO 7704-85 "Оценка мембранных фильтров, используемых
для микробиологических анализов" ("Water quality. Evaluation of membrane filters used for microbiological
analyses").

14. ISO 8199:1988 "Общее руководство по определению
количества микроорганизмов с помощью питательной среды".

15. ISO 9998:1991(Е) "Качество воды. Методы оценки и
контроля микробиологического подсчета колоний в средах с применением тестов
качества воды".

16. ISO
10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages
- Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages".

17. ISO
10705-1:1995 "Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages
- Part 2: Enumeration of somatic bacteriophages".

18. NFT 90-414.
AFNOR, 1985.

19. Programme N
100/03. Analyses des eaux. COFRAC SECTION ESSAIS, 1997.

20. Report on
Public Health and Medical Subjects N 71. Methods for the Examination of Waters
and Associated Materials. Part 1. Drinking Water. The Microbiology of Water,
1994.

 

 

 

 

 

 

Приложение 1

(информационное)

 

СТРУКТУРА ВНУТРЕННЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

ПО ОБЪЕКТАМ КОНТРОЛЯ

 

┌────────────────────────┬────────────┬──────────────────────────┐

│┌────────────┐         
│┌──────────┐│              
┌─────────┐│

││Оборудование│          ││Эталонные
││              
│Расходные││

││и помещения
│         
││культуры 
││              
│материалы││

│└────────────┘          ││Ведение,  ││              
└─────────┘│

│┌─────────────────────┐
││контроль  ││
┌───────────────────────┐│

││Термостаты,
холодиль-│
│└──────────┘│
│Питательные среды:    
││

││ники                 │ │            │ │- контроль
документации││

││Контроль
температур  │ │            │ │- контроль условий
хра-││

│└─────────────────────┘
│            │ │нения                  ││

│┌─────────────────────┐
│            │ │-
контроль приготовле- ││

││Стерилизаторы        │ │            │ │ния                    ││

││паровые и
суховоздуш-│ │           
│ │- качественный контроль││

││ные                  │ │            │ │- количественный конт-
││

││Контроль
стерилиза-  │ │            │ │роль                   ││

││ции:                 │ │            │
└───────────────────────┘│

││-
химический         │ │            │
┌───────────────────────┐│

││-
термический        │ │            │ │Мембранные
фильтры     ││

││-
биологический      │ │            │ │Контроль
эффективности ││

│└─────────────────────┘
│            │
└───────────────────────┘│

│┌─────────────────────┐
│            │
┌───────────────────────┐│

││Фильтровальные
уста- │ │            │ │Реактивы, типовые
сыво-││

││новки                │ &#