ству питательных сред такой важный момент, как
комплексная оценка системы "микроорганизм - фильтр - среда", не нашел
отражения.

Тем не менее, в случаях необходимости сделать выбор между
средами, предлагаемыми разными производителями, оценка качества среды в
комплексе с используемыми в анализе мембранными фильтрами, наряду с
перечисленными в п. п. 11.1 - 11.4.2 исследованиями, будет способствовать
повышению объективности получаемых результатов, а в отдельных случаях может стать
определяющим фактором в принятии решения.

Однозначно признано, что исследования, выполненные на чистых
культурах модельных микроорганизмов, не могут учесть влияния всего многообразия
микроорганизмов естественных водоемов. В этой связи, при проведении сравнительной
оценки дифференцирующих и ингибирующих свойств различных сред, может оказаться
полезным использование природной воды для приближения к натурным условиям.

Однако при выполнении этих исследований необходимо всегда иметь в
виду наличие индивидуальных особенностей каждого водоема, а также
нестабильность во времени как микробиологических характеристик природных вод,
так и уровней химического загрязнения. Эти факты существенно снижают важность
полученных результатов и ограничивают их применение конкретным водоемом.

С учетом изложенного описанная методика носит рекомендательный
характер.

 

11.4.3.1. Подготовительный этап

 

Мембранные фильтры

 

Процент извлекаемости используемых мембранных фильтров должен
составлять не менее 80% на полноценной неселективной среде. Мембранные фильтры
должны быть стерильными.

 

Питательные среды

 

Питательные среды для посева мембранных фильтров не
подсушиваются, но на поверхности разлитых в чашки сред не должно быть видимой
влаги.

 

Подготовка инокулята

 

Подготовку инокулята тестовых культур микроорганизма
осуществляют, как указано в п. 11.4.2.1. В качестве тестовой культуры
используют модельный штамм E.coli M17-02. Посевная доза на фильтр должна
составлять от 25 до 100 КОЕ для фильтров диаметром 47 мм и 25 - 60 КОЕ для
фильтров диаметром 35 мм.

Расчетное засеваемое общее количество тестовых микроорганизмов
должно быть не менее 200, при количестве повторов - не менее 5.

Природная вода используется как естественный источник водных
сапрофитов для оценки ингибирующих и дифференцирующих свойств исследуемых сред.
За сутки до начала исследований природная вода, предназначенная для подготовки
инокулята, должна быть оценена по общепринятым методикам на общее содержание
микроорганизмов (ОМЧ) и наличие искомых колиформных микроорганизмов и до начала
основных исследований помещена в холодильник.

По результатам выполненных контрольных посевов рассчитывают
необходимый объем природной воды. Объем инокулята природной воды должен
содержать сотни - тысячи сапрофитных микроорганизмов. Использование обедненных
по микробному составу природных вод в данных исследованиях нецелесообразно.

В установленный по содержанию сапрофитных микроорганизмов объем
природной воды вносят расчетную посевную дозу тестового микроорганизма
(E.coli).

Если природная вода содержит достаточное количество колиформных
бактерий для посева требуемого количества на один фильтр, модельные
микроорганизмы не используются. При необходимости природная вода может быть
разведена в 10 и более раз.

 

11.4.3.2. Посев методом мембранной фильтрации

 

Суспензию нужного разведения тестовой культуры тщательно
перемешивают, чтобы добиться ее однородности. Предварительно рассчитанную
посевную дозу суспензии вносят в пробирки, содержащие не менее 10 мл
разбавителя. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Количество пробирок,
содержащих посевную дозу тестового микроорганизма, должно соответствовать
количеству предполагаемых посевов методом мембранной фильтрации.

Фильтровальную установку готовят согласно общепринятым
процедурам. Контроль стерильности фильтровальной установки проводят, как
указано в п. 6.5. Стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр на основание
держателя фильтра и присоединяют фильтровальную воронку. При отключенном
вакууме прибавляют 20 - 30 мл стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной
воды. Содержимое пробирки с посевной дозой тщательно перемешивают и асептически
переносят в воронку с разбавителем, включают вакуум и отфильтровывают.

Дважды, при включенном вакууме, ополаскивают воронку 20 - 30 мл
стерильного разбавителя или стерильной дистиллированной воды.

Вакуум отключают, снимают фильтровальную воронку и стерильным
пинцетом переносят мембранный фильтр с основания на питательную среду. Между
мембранным фильтром и поверхностью агара не должно быть пузырьков воздуха.
Чашки с посевами переворачивают и инкубируют в термостате при (37 +/- 1) °C в
течение 18 - 24 часов.

Посев инокулята природной воды осуществляется аналогично
описанному выше с коррективами в отношении объема инокулята природной воды,
который может быть 10 мл и более. В этом случае вносят соответствующее меньшее
количество разбавителя или стерильной дистиллированной воды. Обязательно
проводят двойное споласкивание воронки, как указано выше.

 

11.4.3.3. Методика сравнительных исследований

 

На первом этапе осуществляют отбор сред по параметрам, описанным
в п. п. 11.1 - 11.3, 11.4.1 - 11.4.2.4.

На втором этапе отобранные среды оценивают по показателю
"процент извлекаемости" с использованием двух способов посевов:
прямого (по п. 11.4.2.5) и методом мембранных фильтров. Для каждой исследуемой
среды и варианта посева должно быть выполнено не менее 5 повторов. Контролями
служат прямой посев (контроль N 1) и посев мембранным методом (контроль N 2) на
неселективную среду.

При необходимости могут быть проведены параллельные дополнительные
исследования с инокулятом природной воды. Инокуляты природной воды с внесенными
тестовыми микроорганизмами (или без них) засевают методом мембранных фильтров
на исследуемые селективные среды.

 

Учет результатов

 

Рассчитывается среднее количество колоний для каждой среды,
способа посева и контрольных посевов. Общее количество колоний тестового
микроорганизма на неселективной среде при посеве прямым методом должно быть не
менее 200.

Согласно разделу 12 подтверждают качество используемых в эксперименте
мембранных фильтров путем расчета "процента извлекаемости" для
мембранных фильтров по средним результатам контрольных посевов (прямого N 1 и
мембранного N 2) на неселективный агар.

Далее по п. 11.4.2.5 производят расчет процента извлекаемости и
оценку достоверности различий для исследуемых сред. Контрольным результатом при
этом служит среднее количество колоний, выросших при прямом посеве на
неселективном агаре (контроль N 1).

При посевах природной воды с дополнительным внесением тестовых
микроорганизмов в дальнейших расчетах учитывают полученные накануне результаты
контрольного посева на наличие колиформ. Далее процент извлекаемости
рассчитывается так же, как и в исследованиях с чистыми культурами: в сравнении
с результатами прямого посева тестовых микроорганизмов на неселективный агар
(контроль N 1).

В случае посевов природной воды без дополнительного внесения
тестовых микроорганизмов оценивают достоверность различий результатов,
полученных при посевах на исследуемые среды.

При получении недостоверных различий результатов исследований для
выбора наиболее оптимальной среды необходимо проанализировать следующие
характеристики:

- четкость проявления дифференцирующих признаков для тестового
микроорганизма;

- подавление сопутствующей микрофлоры;

- выявление ингибирующего действия микробного населения природной
воды на тестовую культуру Е.coli.

 

11.5. Контроль на этапе использования

питательных сред

 

В процедуре анализа возможны нарушения использования питательных
сред (перегрев, чрезмерная инкубация при высокой температуре и т.д.),
приводящие к ухудшению их ростовых свойств. Кроме того, возможно неверное
толкование полученного результата вследствие слабой выраженности признака у
исследуемого микроорганизма. Контроль на этом этапе позволяет минимизировать
подобные проблемы.

Контроль сред на этапе использования включает:

- контроль температурного режима водяных бань, предназначенных
для поддержания плотных питательных сред в расплавленном состоянии;

- учет времени нахождения среды в расплавленном состоянии;

- постановку положительного и отрицательного контролей в процессе
идентификации микроорганизмов.

Данный вид контроля проводится при каждом использовании
питательных сред.

 

11.5.1. Контроль температурного режима водяных

бань, предназначенных для поддержания плотных

питательных сред в расплавленном состоянии

 

Температура водяной бани должна находиться в пределах (47 +/- 2)
°C.

 

11.5.2. Контроль времени нахождения

питательной среды в расплавленном состоянии

 

Питательная среда не должна находиться в расплавленном состоянии
более 8 часов. Повторное плавление плотной питательной среды не допускается.

 

11.5.3. Постановка положительного

и отрицательного контролей

 

Постановку контролей осуществляют в процессе идентификации
микроорганизмов при выполнении подтверждающих тестов.

 

Тестовые культуры

 

В качестве тестовой культуры используют штамм Е.coli M17-02.
Подготовка инокулята. Накануне исследования тестовую культуру готовят, как
указано в п. 10.2.4.

 

Методика контроля

 

Постановку положительного контроля осуществляют путем внесения
одной петли агаровой культуры тестового штамма в пробирку с используемой средой
(средами) для идентификации. Отрицательным контролем служит пробирка с
аналогичной средой без посева. Обе пробирки маркируют и помещают в термостат
вместе с посевами.

 

Учет результатов

 

По истечении срока инкубации в пробирке с положительным контролем
должен наблюдаться хорошо различаемый рост, со всеми типичными для него
отличительными признаками, которые предполагается выявлять на данной среде.
Цвет индикатора среды должен изменяться на цвет, определяемый в паспорте среды,
как положительный результат утилизации данного углевода. В пробирке с
отрицательным контролем среда должна находиться без изменений. Результаты
положительного и отрицательного контролей заносятся в рабочий журнал основного
исследования.

 

11.6. Ростовые характеристики ряда сред

отечественного производства, применяемых

в санитарно-бактериологическом анализе воды

 

ГРМ-бульон, питательный бульон и их аналоги

 

    В качественном  
контроле   среда   должна 
обеспечивать  рост

тестового штамма Е.coli
в  виде 
диффузного  помутнения  среды 
не

позднее   18  
-   24  часов  инкубации  при 
(37  +/-  1) 
°C.  В

количественном контроле
среда должна обеспечивать  рост  тестового

                                                           -7

штамма во всех пробирках
при посеве 1,0 мл из разведения 10    
не

позднее 20 - 24 часов
инкубации при (37 +/- 1) °C.

 

ГРМ-агар, питательный агар и их аналоги

 

    В качественном 
контроле  среда   должна  
обеспечивать   рост

тестового  штамма 
Е.coli  в  виде 
бесцветных  прозрачных круглых

колоний в S-форме не
позднее 20 - 24 часов инкубации при 
(37  +/-

1)  °C. 
В  количественном контроле среда
должна обеспечивать рост

тестового штамма  Е.coli 
в  виде  бесцветных  прозрачных  круглых

колоний  в 
S-форме  на всех чашках при
посеве 100 мкл (0,1 мл) из

             -6

разведения 10   не позднее 18 - 20 часов инкубации при (37
+/-  1)

°C.

Если среду предполагается использовать в качестве контрольной в
исследовании по определению показателя ингибиции, то процент всхожести должен
составлять не менее 80% по сравнению со средой ранее проверенной партии, а
различие между ними должно быть недостоверно.

 

Агар Эндо с добавками

 

В качественном контроле среда должна обеспечивать рост тестового
штамма Е.coli в виде красных (малиновых) с металлическим блеском круглых
колоний диаметром 2,0 - 3,0 мм, с образованием зоны потемнения среды вокруг
колонии ("отпечатка") не позднее 20 - 24 часов инкубации при (37 +/-
1) °C.

    В количественном   контроле  среда 
должна  обеспечивать  рост

типичных колоний Е.coli на
всех чашках при посеве 100 мкл (0,1 мл)

                 -6

из  разведения 10   не позднее 18 - 20 часов инкубации при (37 +/-

1) °C.

    При посеве   смеси   тест-штаммов  должна  наблюдаться  четкая

дифференциация
колоний:  в отличие  от 
малиновых  колоний  Е.coli

колонии шигелл более мелкие
с окраской от белого до слабо-розового

цвета, без отпечатка на
среде.

    Среда должна подавлять рост Staphylococcus aureus  при 
посеве

                                        -1

0,1 мл микробной взвеси из
разведения 10  .

 

Среды с лактозой и глюкозой