анной
методике.

Пробы,
не прошедшие предварительную обработку, могут храниться при температуре 15 - 20
град. C не более двух суток.

В
случае если первичная обработка пробы воды (фильтрование) проводилась вне
лаборатории, использованные фильтры помещают в широкогорлый флакон или
стеклянную банку, добавляют 30 - 50 мл исходной воды; закрывают флакон или
банку завинчивающейся или притертой крышкой, маркируют, указывают дату, место
отбора, количество профильтрованной воды и транспортируют в лабораторию для
дальнейшего исследования. При невозможности исследования в день отбора материал
хранят при 4 град. C не более суток; при отсутствии необходимости определения
жизнеспособности цист кишечных простейших и яиц гельминтов материал хранят при
4 град. C не более 3 - 4 суток после добавления в него формальдегида с таким
расчетом, чтобы концентрация его в суспензии составила 2%.

 

5. Ход исследования

 

Перед
началом фильтрации мембранные фильтры должны быть подвергнуты 10-минутному
кипячению в дистиллированной воде для удаления посторонних частиц из пор
фильтров, препятствующих оптимальному проведению процесса фильтрации.

Питьевая
вода исследуется в объеме не менее 50 л, вода водоисточников - в объеме не
менее 25 л.

Исследуемый
объем воды с помощью фильтровального устройства пропускают через мембранные
фильтры (см. раздел "Оборудование и материалы"). По мере замедления
процесса фильтрации из-за загрязнения фильтра его заменяют новым, а
использованные фильтры с осадком помещают в широкогорлую емкость (стаканчики
ВН) с помощью чистого пинцета (предварительно прокипяченного или обработанного
спиртом) и заливают исследуемой водой в количестве 30 - 50 мл для сохранения их
во влажном состоянии.

По
окончании фильтрации всей пробы осуществляется смыв осадка с фильтров. Каждый
фильтр чистым пинцетом опускается в стаканчик с дистиллированной водой;
придерживая пинцетом фильтр, осторожно смывают осадок при помощи чистой мягкой
кисточки, затем фильтр еще раз прополаскивают в другой порции дистиллированной воды.
При использовании фильтров с диаметром диска более 35 мм рекомендуется
разрезать их чистыми ножницами на несколько частей для удобства и более
эффективной отмывки. Данную операцию удобнее проводить в чашках Петри.

По
окончании отмывки всех фильтров кисточку также тщательно прополаскивают в
небольшом объеме дистиллированной воды (5 - 10 мл). Процедура отмывки фильтров
и кисточки требует особой тщательности во избежание возможных потерь цист
простейших и яиц гельминтов.

Весь
полученный смыв центрифугируют в пробирках емкостью 10 мл или более в течение 5
мин. при 1500 об/мин. (600 g). Надосадочную жидкость сливают. При отсутствии
необходимости определения жизнеспособных цист и яиц гельминтов осадок помещают
в 6 - 8 мл 2%-ного водного раствора формалина и размешивают.

Если
предполагается определение жизнеспособности паразитарных патогенов, к осадку
добавляют воду для отмывания его. Суспензии вновь центрифугируют в прежнем
режиме, после чего удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 3 мл
одного из флотантов и тщательно перемешивают чистой стеклянной палочкой.
Центрифугируют 5 мин. при 2000 об/мин., или 10 мин. при 1500 об/мин., после
чего надосадочную жидкость переносят пипеткой в центрифужную пробирку,
разбавляют не менее чем в 4 раза дистиллированной водой. Центрифугируют в
прежнем режиме, удаляют надосадочную жидкость, а из осадка готовят препараты на
предметных стеклах.

В
зависимости от задач исследования препарат не окрашивают или подвергают
окраске. Если нужно провести только подсчет паразитарных агентов без
определения их жизнеспособности, препарат не окрашивается или его окрашивают 1
каплей 3%-ного раствора Люголя. Вероятную жизнеспособность цист лямблий можно
определять, окрашивая препарат 1 каплей 1%-ного водного эозина.

Готовые
препараты накрывают покровным стеклом и микроскопируют, сканируя всю площадь
покровного стекла, с использованием 100 - 600-кратного увеличения (объективы -
10x, 40x, окуляры - 10x, 15x) сухой оптической системы. Для определения более
тонких внутренних структур цист простейших, имеющих значение для их
идентификации, используют масляно - иммерсионный 90 - 100-кратный объектив или
фазово - контрастное микроскопирование. Таким образом микроскопируется весь
объем полученного осадка. При необходимости проводят визуальную оценку
вероятной жизнеспособности цист лямблий и других простейших, а также яиц
гельминтов.

Микроскопирование
и идентификация паразитарных патогенов в пробах воды должны выполняться
специалистом, умеющим отличать их от фитопланктона и яиц гидробионтов.

На
обработку одной пробы требуется не менее 10 человеко-часов. Результат анализа
может быть получен не ранее чем на следующий рабочий день после доставки пробы.

 

6. Оценка результатов исследования

 

При
микроскопировании подсчитывают число паразитарных патогенов во всем объеме
осадка, что соответствует их числу во всей исследованной пробе. Одновременно
определяют систематическую принадлежность обнаруживаемых паразитических
организмов; идентификация их проводится по следующим признакам.

Цисты
лямблий - овальная форма, размеры 10 - 14 мк в длину и 6 - 10 мк в ширину;
незрелые цисты содержат 2 ядра, зрелые - 4; ядра находятся у переднего полюса
цисты. Оболочка цисты отчетливо выражена и большей частью отстает от
протоплазмы, что является одним из характерных отличий цист лямблий от цист
других простейших. Внутри цисты вдоль по средней линии проходят две опорные
нити - аксостили; в косом или поперечном направлении лежат характерные
парабазальные тела (2 - в незрелых и 4 - в зрелых цистах), нередко заметен
сложно свернутый жгутиковый аппарат. Плотность 1,06 - 1,09.

Цисты
амебы дизентерийной - округлая, редко овальная форма, размеры от 10 до 16 мк;
молодые цисты содержат 1 - 2 ядра с центрально расположенной звездчатой
кариосомой, зрелые цисты содержат 4 ядра, в зрелых четырехъядерных и незрелых
двухъядерных цистах ядра расположены в различных плоскостях; оболочка цист
двухконтурная в виде светлого прозрачного ободка. Одноядерные цисты почти
всегда содержат в большом количестве гликоген, который в виде крупной вакуоли с
нерезкими очертаниями занимает обычно больше половины цисты и раствором Люголя
окрашивается в темно - коричневый цвет. Плотность 1,08 - 1,1.

Следует
иметь в виду, что в природной воде могут встречаться цисты Entamoeba dispar,
идентичные цистам дизентерийной амебы, но не обладающие патогенными свойствами
для человека. В этом случае следует в протоколе исследования отмечать находки
без указания видовой принадлежности таких цист. Для идентификации их необходимы
дополнительные специальные исследования. Однако и в данной ситуации должна быть
настороженность в отношении эпидемического неблагополучия.

Цисты
балантидия кишечного - правильная круглая форма, плотная двухконтурная
оболочка, средний размер около 50 мк. Внутри цист имеется крупное бобовидное
ядро. Протоплазма однородна, гликоген в ней распылен равномерно. Под оболочкой
в некоторых цистах заметно углубление, представляющее собой редуцированный
цитостом - органеллу, соответствующую началу пищеварительной трубки
многоклеточных. Ресничный покров отсутствует. Плотность 1,1.

Яйца
аскариды человеческой (свиной) - оплодотворенные яйца овальной или шаровидной
формы. Наружная оболочка крупнобугристая, толстая, коричневого цвета (иногда
встречаются яйца без наружной бугристой оболочки). Размеры яиц 50 - 70 x 40 -
50 мк. Яйцеклетка мелкозернистая и шаровидная, расположена в центре яйца.
Плотность 1,10 - 1,14.

Зрелое
яйцо (способное заразить при заглатывании) содержит внутри подвижную личинку,
свернувшуюся кольцевидно или перекрестно.

Яйца
токсокары (аскариды собачьей) - почти круглые, 65 - 75 мк в диаметре, с
нежноячеистой наружной толстой оболочкой темно - коричневого цвета, внутри яйца
видна округлая зародышевая клетка. Зрелые инвазионные яйца содержат внутри
подвижную свернувшуюся кольцом или перекрестно личинку. Плотность 1,22.

Яйца
власоглава - симметричные, имеют лимонообразную или бочонковидную форму.
Оболочка темно - коричневая, толстая. На обоих полюсах имеются светлоокрашенные
пробковидные образования. Размеры яиц 50 - 54 x 23 - 26 мк. В зрелых
инвазионных яйцах видна подвижная личинка. Плотность 1,16 - 1,22.

Яйца
острицы - асимметричные. Одна сторона заметно уплощена, другая выпукла. Размеры
яиц 50 - 60 x 30 - 32 мк. Оболочка тонкая, гладкая и бесцветная. Яйца могут
быть на различных стадиях созревания, до головастикоподобной личинки
включительно. Плотность 1,14.

Яйца
цепня карликового - оболочка яйца бесцветная, тонкая, гладкая. Форма овальная.
Размер яиц 40 x 50 мк, эмбриофора (зародыш) почти шаровидная (29 x 30 мк), с
длинными нитевидными придатками на полюсах. Плотность 1,12.

Онкосферы
тениид (цепня свиного и эхинококков) - овальная форма, размеры 31 - 40 x 2 - 30
мк; имеют тонкую наружную оболочку и толстую радиально - исчерченную внутреннюю
оболочку темно - коричневого цвета. Внутри онкосферы находится зародыш -
эмбриофора с шестью зародышевыми крючьями. Плотность 1,24.

Отрицательный
результат анализа не гарантирует отсутствия паразитарных патогенов в пробе,
поэтому результат исследования должен представляться в протоколе термином
"не обнаружены". Обнаружение даже одного экземпляра паразитарных
патогенов в 1 пробе питьевой воды указывает на эпидемиологическое
неблагополучие в системе питьевого водоснабжения.

 

7. Визуальная оценка вероятной жизнеспособности
цист

патогенных простейших кишечника и яиц гельминтов

 

Оценка
вероятной жизнеспособности цист патогенных простейших и яиц гельминтов
визуально проводится по следующим критериям, подтверждающим жизнеспособность:

-
целостность наружной оболочки (отсутствие ее разрывов, вдавлений, выбухания,
сморщивания);

-
четкая внутренняя структура цисты или яйца: у цист - четко видны ядра,
отсутствует зернистость. У цист лямблий, кроме того, видны аксостили,
жгутиковый аппарат, медиальное тело. Для яиц гельминтов (аскарид, токсокар,
власоглавов, остриц) характерно наличие дробящейся зародышевой клетки или
подвижной личинки. У живых онкосфер тениид и карликового цепня зародышевые
крючья расположены попарно, а у мертвых - беспорядочно;

- при
окраске препарата 1%-ным водным раствором эозина жизнеспособные цисты лямблий
не воспринимают окраску в течение первых 5 мин., мертвые окрашиваются сразу же
в розовый цвет. Поэтому указанную окраску следует использовать до микроскопии
только в том случае, когда на изучение препарата потребуется не более 5 мин.
Часто просмотр мазка длится 15 - 30 мин., тогда 1%-ный водный эозин можно
вводить аккуратно, не сдвигая препарат, под покровное стекло пипеткой в точке,
где при предварительном просмотре уже обнаружены цисты лямблий;

-
жизнеспособность онкосфер тениид и яиц аскарид, содержащих личинку, определяют
путем окрашивания препарата смесью, содержащей метиленовый синий (см. п.
3.3.6). Живые онкосферы тениид, а также личинки, находящиеся внутри яиц
аскарид, не окрашиваются в течение первых 15 мин. Мертвые окрашиваются сразу в
синий цвет;

-
жизнеспособность онкосфер тениид можно также определить по движению зародышей
при воздействии на них пищеварительными ферментами. Для этого исследуемый
осадок, содержащий онкосферы, помещают на часовое стекло в искусственный
дуоденальный сок (см. п. 3.3.7). Стекло ставят в термостат при 36 - 38 град. C
на 4 ч. Живые зародыши освобождаются от оболочек, а мертвые - нет;

-
оболочки жизнеспособных онкосфер растворяются также в подкисленном пепсине (pH
5 - 6) и в щелочном растворе трипсина (pH 8 - 8,5) через 6 - 8 ч при температуре
38 град. C.

Схема
выполнения методики санитарно - паразитологического исследования воды и
изображения определяемых с ее помощью цист кишечных простейших и яиц гельминтов
представлены в приложениях 1, 2, 3 <*>.

    --------------------------------

<*>
Не приводятся.