тока 120 - 160 мА в течение ночи (12 - 14 ч).

После окончания
электропереноса нитроцеллюлозный фильтр промывают в трех сменах 0,01М PBS
(натрий - фосфатный буфер, pH 7,4) по 5 мин.

Для детекции перенесенных
на мембрану белков фильтр в течение 5 - 10 мин. инкубируют в растворе красителя
(0,25% понсо-с, 40% уксусной кислоты, 15% метанола). Фоновую окраску отмывают
0,01М PBS.

На заключительном этапе,
перед связыванием моноклональных антител, фильтр промывают в 0,1М PBS,
содержащем 30% изопропанола (для удаления SDS), 3 раза по 20 мин., затем
пятикратно в 0,01М PBS и 0,01М PBS-0,05% tween-20. Возможную неспецифическую
сорбцию антител подавляют инкубацией фильтра в растворе 1% БСА на 0,01М PBS в
течение 1 ч при 37 град. C (или в течение ночи при +4 град. C). Фильтр
промывают 0,01М PBS пятикратно, затем 0,1М PBS-0,05% твин-20 пятикратно.
Наконец, проводится его инкубация в растворе соответствующих антител в 0,1М PBS
(разведение подбирается в каждом случае). После инкубации с МКАТ фильтр
отмывают 5 раз 0,1М PBS и 5 раз 0,1 PBS-0,05% твин-20 и инкубируют с
пероксидазным коньюгатом против Ig G мыши 2 ч при 37 град. C. После пятикратных
промывок 0,1М PBS и 0,1М PBS-твин-20 фильтр заливают буфером для окрашивания
(12 мг 4-хлор-1-нафтола растворяют в 4 мл этанола, объем доводят до 20 мл 0,1М
PBS и непосредственно перед применением добавляют 12 мкл 30-процентной перекиси
водорода) и выдерживают до четкого проявления окрашенных зон.

5.5.4. Оценка
биологических эффектов от продукта(ов) функционирования вставки.

5.5.4.1.
Полупрепаративное выделение препаратов белков после фракционирования белковых
экстрактов двумерным электрофорезом.

Для получения отдельных
очищенных белковых препаратов двумерным электрофорезом фракционируют суммарные
белковые экстракты в стандартных, описанных выше условиях. Затем детекцию
белковых фракций проводят в нефиксирующих условиях 4 М раствором ацетата калия.
Одноименные фракции вырезают из 20 - 40 гелевых пластин и собранные кусочки
гелей до момента выделения хранят при -20 град. C.

Некоторые белки удается
элюировать за счет диффузии. В этих случаях полученные кусочки гелей,
содержащие одноименный белок, измельчают и гомогенизируют в деионизованной
воде, после чего белок элюируют в течение 15 - 20 мин. из гомогената геля
встряхиванием на магнитной мешалке. После центрифугирования в течение 20 мин.
при 700 g супернатант собирают и процедура с осадком повторяется еще два раза.
Объединенный супернатант (объем около 50 мл) лиофилизируют, осадок
перерастворяют в 1 - 2 мл деионизованной воды и на холоде производят
освобождение от избытка додецилсульфата натрия. Выпавший осадок отделяют
центрифугированием (15 мин. при 3000 g), что обеспечивает понижение
концентрации SDS в супернатанте до 0,25% [134]. Затем от остатка солей и SDS
избавляются диализом против дистиллированной воды в течение 12 часов при
температуре +4 град. C.

Неэлюирующиеся прямо
белки получают электроэлюцией. Электроэлюцию проводят в приборе для фирмы
"Bio-Rad" (США) или аналогичном оборудовании. При первом употреблении
диализной мембраны (поставляемой в комплекте с прибором) ее инкубирют в течение
30 мин. в электродном буфере для электрофореза (раствор 2.6) при температуре 60
град. C. Фрагменты геля, содержащие искомую фракцию, укладывают в стеклянную
трубку, соединенную с диализной мембраной и заполненную электродным буфером для
электрофореза. Трубку устанавливают в прибор, в верхнюю и нижнюю камеру
заливают буфер для электрофореза, подключают электроды и процесс проводят в
течение ночи при постоянной силе тока из расчета 5 мА на каждую трубку и
ограничении по напряжению. Белок концентрируется в объеме около 400 мкл буфера,
этот раствор собирают, мембрану промывают и эту порцию раствора прибавляют к
основной. В дальнейшем раствор белка подвергают диализу, измеряют концентрацию белка
по методу Бредфорд и лиофилизируют.

В работе для определения
концентрации белка в различных растворах используют методику Бредфорд [136]. В
основе метода лежит связывание красителя кумасси бриллиантового голубого G-250
с белком в растворе.

Для анализа отбирают
образцы (разбавленные в случае необходимости), содержащие 1 - 10 мкг белка в
0,1 мл. К 25 мкл образца добавляют 25 мкл раствора красителя, содержащего 0,05%
кумасси бриллиантового синего G-250, 5% этанола, 10% ортофосфорной кислоты и
измеряют поглощение при 594 нм. Концентрацию белка определяют по калибровочной
кривой, построенной для раствора бычьего сывороточного альбумина
("Serva").

5.5.4.2. Проверка
биологических свойств продукта функционирования вставки на культурах клеток
человека.

Для проверки
биологических свойств продукта функционирования вставки используют тест -
системы на основе культур постнатальных диплоидных фибробластов человека,
полученных как описано ранее [137].

Культивирование клеток
проводят в питательной среде DMEM (фирмы "ПанЭко", РФ) с добавлением
5% сыворотки крупного рогатого скота и 5% сыворотки пуповинной крови человека
(фирма "ПанЭко", РФ), используя или стеклянные флаконы Карреля, или
пластиковые одноразовые матрасы фирмы "Costar" (Нидерланды), или в
96-луночные планшеты фирмы "Nunc" (Дания). В качестве органических
красителей применяют витальный краситель метиленовый синий [138] и краситель
Гимза [139] (фирма "Merck", Германия).

На первом этапе
устанавливают зависимости между количеством клеток в лунке и интенсивностью окраски
метиленовым синим, для чего клетки высевают с различной плотностью в
96-луночные планшеты и культивируют в течение 1 суток при 37 град. C. Далее
клетки прижизненно окрашивают в течение 1 ч метиленовым синим, добавляя в
каждую лунку 25 мкл раствора красителя. Затем окрашенные клетки дважды
споласкивают водой и высушивают на воздухе. Измерение оптической плотности
материала лунок проводят на электрофотометре "ЭФОС 9305" (фирма
"ЭФОС", РФ) при 594 нм. Результаты определения оптической плотности и
количества посеянных в лунку клеток обрабатывают с помощью компьютерной
программы "SigmaPlot" или аналогичных компьютерных программ.

При изучении влияния
продукта функционирования вставки на пролиферативную способность фибробластов
человека к клеткам, растущим в 96-луночных платах, добавляют разные количества
препарата этого белка и после 4 суток культивирования пробы окрашивают
метиленовым синим, как описано выше. Параллельно все пробы микроскопируют
(МБИ-3, ЛОМО, адаптированный как инвертированный микроскоп с помощью
специальной насадки) для оценки морфологического состояния растущих клеток.

Перед окрашиванием
красителем Гимза клеточную суспензию разной плотности в среде DMEM с 10%
эмбриональной телячьей сыворотки в объеме 200 мкл вносят в лунки 96-луночной
платы. При этом первый вертикальный ряд лунок служит контролем, его не
заполняют клеточной суспензией. Платы инкубируют в атмосфере 5-процентного
углекислого газа при температуре 37 град. C. Через сутки клетки фиксируют
добавлением в каждую лунку 50 мкл холодного свежеприготовленного
2,5-процентного глютарового альдегида. Через 30 мин. фиксации при 4 град. C
фиксатор из лунок удаляют, лунки дважды промывают холодным раствором Хенкса и
заполняют 100 мкл красителя Гимза, специфически связывающегося с хроматином, разведенного
1:50 непосредственно перед использованием. Клетки инкубируют с красителем 3 ч
при 37 град. C. Затем краситель удаляют, лунки дважды промывают раствором
Хенкса, заполняют 100 мкл элюирующего раствора (0,1 М NaH2PO4 : C2H5OH - 1:1) и
инкубируют при комнатной температуре 15 мин. при непрерывном перемешивании.
Измерение оптической плотности элюирующего раствора проводят на фотометре
"ЭФОС 9305" при длине волны 620 нм.

 

6. Оценка
пищевой продукции, полученной

из
генетически модифицированных источников,

по
функционально - технологическим свойствам

 

6.1. Необходимость
проведения тех или иных исследований по разделу 6 определяется экспертом
Московского государственного университета прикладной биотехнологии Министерства
общего и профессионального образования Российской Федерации.

6.2. В жизнедеятельности
человеческого организма главенствующую роль играет белок, поэтому
представляется важным проследить, не претерпевает ли он каких-либо изменений в
процессе генетической модификации, поскольку генная инженерия может привести к
изменению структуры и функции белков, в частности ферментов.

Свойства белка однозначно
связаны с его структурой. Основным методом исследования структуры белка
является метод рентгеноструктурного анализа его кристаллов. Однако для большинства
белков, используемых в питании, данные об их структуре по ряду причин
неизвестны. С другой стороны, известно, что структура белков также определяет
их термодинамические свойства, которые, в свою очередь, влияют на их
функциональные свойства.

Существует ряд методов
измерения термодинамических свойств, среди которых предпочтительным методом
является калориметрия. Этот метод позволяет измерять температурную зависимость
теплоемкости. Из полученной зависимости можно вычислить теплоемкость для
нативной и денатурированной форм белка, энтальпию и температуру денатурации
белка. Вычисленные термодинамические параметры позволяют определить
интегральную гидрофобность и конформационную стабильность белков [38 - 40].
Указанные характеристики тесно связаны с главными функциональными свойствами
[41 - 44].

Метод ионопарной
высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенных фазах позволяет
идентифицировать единичные замены аминокислотных остатков в белковой
макромолекуле и незаменим при сравнительном исследовании белков [44].

В процессе изменения
генома организма в нем накапливаются компоненты, обеспечивающие его
устойчивость к внешним неблагоприятным факторам - заболеваниям, насекомым -
вредителям или гербицидам и т.д. В определенных концентрациях эти компоненты
могут быть опасными для здоровья человека, употребляющего в пищу продукты,
полученные с применением методов генной инженерии. Поэтому в процессе
промышленной переработки такого сырья могут потребоваться изменения в
существующих технологиях, обеспечивающие минимальное остаточное содержание
опасных для здоровья компонентов. Такие изменения в технологии могут сказаться
на качественных показателях (функционально - технологических свойствах)
белковых препаратов, вырабатываемых из генетически модифицированного сырья.
Кроме этого, предполагается целенаправленное изменение аминокислотного состава
белков, выделяемых из генетически модифицированной пищевой продукции (например,
имеющих сбалансированный АКС), для повышения их пищевой ценности. Это неизбежно
повлечет изменение функционально - технологических свойств коммерческих
белковых препаратов и отразится на качестве пищевых продуктов, в которых они
используются. Это, в свою очередь, может привести к необходимости внесения
изменений в технологические процессы, использующие эти препараты. Поэтому
необходим непрерывный контроль (мониторинг) свойств белковых препаратов,
вырабатываемых из генетически модифицированного пищевого сырья при, безусловно,
безопасном содержании компонентов вредных для здоровья человека.

Микро- и макростабильность
белковой молекулы определяет ряд наиболее важных функциональных свойств белка,
таких, как растворимость, способность стабилизировать эмульсии и пены,
образовывать гели, удерживать жир и влагу [9 - 13].

Эти функциональные
свойства напрямую связаны с характеристиками готовых пищевых продуктов.

 




Функциональное свойство


Влияние на характеристики готового  
продукта              




pH водной суспензии   


характеристика белковых препаратов;    
определяет принципиальную возможность  

использования белкового препарата в    

конкретном виде продукции              





Растворимость         


используют в качестве первичного показа-
теля качества белковых препаратов;     

обусловливает реологические свойства   

белоксодержащих пищевых систем, устойчи-
вость эмульсий, стабилизированных бел- 

ком, жироудерживающую способность белко-
вых препаратов                         





Реологические свойства
водных дисперсий      


определяют уровень введения препаратов 
в продукт, обеспечивающий требуемый     
комплекс реологических свойств готового
продукта, влияет на режимы материальных
потоков в технологическом процессе     





Водоудерживающая и    
жироудерживающая      
способность           


влияют на уровень введения в продукт   
белковых препаратов, обеспечивающий    

снижение потерь при технологической    

обработке (варке и жаренье), однородную
консистенцию изделий, снижение брака в 

результате отделения воды и жира,      

сокращения объема изделий              





Критическая концентра-
ция гелеобразования   


определяет уровень введения в продукт  
белковых препаратов, обеспечивающий    

требуемый комплекс структурно - механи-
ческих характеристик готового продукта 





Эмульсионная          
стабильность          


определяет уровень введения в продукт  
белков