кумасси бриллиантовый голубой R-250, кумасси
бриллиантовый голубой G-250, Tween-20, 4-хлор-l-нафтол, бычий сывороточный
альбумин - фирмы "Serva" (Германия); ТВИН-20 - фирмы "Merk"
(Германия) амфолины pH 3 - 10, pH 5 - 7, pH 5 - 8, фирмы "LKB"
(Швеция).

В качестве расходных
материалов применяются также: нитроцеллюлозные фильтры - фирмы "Schleicher
and Schull" (Германия).

Белковые экстракты из
всех изучающихся биологических материалов готовят сходным образом, используя
для обеспечения максимальной солюбилизации белков лизирующий раствор (ЛР), с
высоким содержанием денатурирующих агентов - мочевины, меркаптоэтанола
(дитиотриэтола) и тритона X-100. ЛР - раствор 9 М мочевины, содержащий 5%
2-меркаптоэтанола, 2% тритон X-100, 2% амфолины 3,5 - 10.

При приготовлении ЛР
сначала мочевину растворяют в деионизованной воде и дополнительно очищают
добавлением Амберлит МВ-1. После 10 мин. инкубации амберлит отделяют и к
раствору мочевины добавляют Тритон X-100, дитиотриэтол (или 2 -
меркаптоэтанол), амфолины pH 3 - 10 до указанных концентраций.

При экстракции белков
образцы тканей измельчают ножницами и несколько раз промывают холодным
физиологическим раствором. Затем измельченную ткань гомогенизируют в стеклянном
гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в ЛР в соотношении 100 мг ткани на 2 мл ЛР
и центрифугируют при 700 g в течение 10 мин. Надосадочную фракцию, содержащую
солюбилизированные белки (экстракт), используют для дальнейшей работы.

Для анализа белков
используют двумерный электрофорез по О'Фарреллу - метод, сочетающий
фракционирование белков изоэлектрофокусированием (первое направление) с гель -
электрофорезом в присутствии SDS [128, 129].

Изоэлектрофокусирование
проводят в стеклянных трубках длиной 150 мм и внутренним диаметром 3,5 мм.
Трубки устанавливают в штатив, герметизируют нижние отверстия пленкой Parafilm
и заливают полимеризационной смесью. Для составления полимеризационной смеси
готовят следующие реактивы:

1.1. 30-процентный
акриламид, 1,6% метиленбисакриламид.

1.2. 20% тритон X-100.

1.3. 10-процентный
персульфат аммония.

1.4. Анодный буфер для
изоэлектрофокусирования: 0,01 М фосфорная кислота.

1.5. Катодный буфер для
изоэлектрофокусирования: 0,02 М NaOH.

1.6. Защитный раствор:
4,5 М раствор мочевины, содержащий 1% Тритона X-100; 2,5% меркаптоэтанола, 1%
амфолинов pH 3,5 - 10.

1.7. Переводный буфер для
геля первого направления - белковый буфер (см. п. 2.2).

Растворы 1.1; 1.2; 1.6;
1.7 хранят при температуре +4 град. C в течение 2 - 3 недель. Остальные
используют свежеприготовленными.

Приготовление 20 мл
полимеризационной смеси, необходимой для заполнения 12 трубок, осуществляют,
смешивая 12 г мочевины, 6,75 мл дистиллированной воды, 3 мл раствора 1.1, 2,25
мл раствора Тритона X-100 (20%). Эту смесь обрабатывают ионообменной смолой
амберлит МБ-1, отфильтровывают и добавляют к ней 225 мкл амфолинов pH 3,5 - 10
и 900 мкл амфолинов pH 5 - 7. Смесь дегазируют, а непосредственно перед
заливкой в трубки к ней добавляют 22,5 мкл ТЕМЕД и 32,5 мкл 10-процентного
раствора ПСА.

Полимеризационную смесь в
трубки вносят шприцом, заполняя трубки снизу вверх до одинакового уровня на 2 -
3 см ниже верхнего края (высота колонки геля 11 см). Сверху наслаивают воду.

После окончания
полимеризации геля воду над его поверхностью удаляют и трубки устанавливают в
гельэлектрофоретическую камеру "Bio-Rad", модель 175 (США). В нижний
резервуар камеры наливают раствор катодный буфер. В трубки наносят
анализируемые образцы в объеме 50 - 150 мкл (100 мкг белка). В
полупрепаративном варианте фракционирования объем наносимого образца
увеличивают до 250 - 350 мкл. Сверху, по краям трубки, наслаивают защитный
раствор 1.7 и верхнюю камеру прибора заполняют анодным буфером.

Изоэлектрофокусирование
до равновесного состояния проводят при напряжении, начиная с 400 В до 200 В.ч,
и затем при напряжении 1000 В до суммарного значения 5400 В.ч, или (ночной
режим), при напряжении 210 В двадцать часов и затем один час 1000 В до того же
суммарного значения 5400 В.ч. Неравновесный вариант изоэлектрофокусирования
проводят при напряжении, начиная с 400 В до 200 В.ч, и затем при напряжении
1000 В.ч до суммарного значения 1000 - 2500 В.ч.

По окончании
изоэлектрофокусирования колонки геля вымачивают в 5 мл переводного буфера
(раствор 1.7) 10 мин. при комнатной температуре. Затем гели, не предназначенные
для немедленного фракционирования во втором направлении, быстро замораживают и
хранят при температуре -20 град. C до нескольких недель.

Для фракционирования во
втором направлении используют модифицированный метод Леммли [130] в пластинах с
градиентом ПААГ 7,5 - 25% в присутствии SDS.

Для этой цели готовят
следующие растворы, из которых затем составляют полимеризационные смеси для
формирования пластин ПААГ:

2.1. 60-процентный
акриламид, 0,8-процентный метиленбисакриламид.

2.2. Буфер для
разделяющего геля: 1 М Трис-HCl (pH 8,8).

2.3. Буфер для
концентрирующего геля: 0,5 М Трис-HCl (pH 6,8).

2.4. 10-процентный
додецилсульфат натрия.

2.5. 10-процентный
персульфат аммония.

2.6. Электродный буфер
для электрофореза: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин, 0,1-процентный SDS (pH 8,3).

2.7. Агарозный гель: 1%
агароза в растворе 2.6 с добавлением 0,125% бромфенолового синего. После
приготовления раствор необходимо прокипятить в течение 5 мин., а перед каждым
использованием гель необходимо растопить.

Раствор 2.5 готовят
непосредственно перед употреблением, остальные хранят при температуре +4 град.
C.

Фракционирование во
втором направлении осуществляют в пластинах ПААГ размером 160 x 160 x 1 мм с
линейным градиентом концентрации акриламида 7,5 - 25%, в приборе для
вертикального электрофореза. Пластины геля готовят в стандартных стеклянных
кассетах. Пример с подробным описанием использования этого оборудования
опубликован ранее [131].

Обычно для параллельного
формирования 6 гелевых пластин с градиентом концентрации акриламида
(разделяющий гель) готовят 2 раствора: легкий (концентрация АА 7,5%) и тяжелый
(концентрация АА 25%), по 100 мл каждого. Полный состав этих растворов приведен
в таблице.

 

Таблица

 

СОСТАВЫ РАЗДЕЛЯЮЩЕГО
И КОНЦЕНТРИРУЮЩЕГО ГЕЛЕЙ

 




Компоненты          


Разделяющий гель


Концентрирующий
гель     




 


25%  


6,5% 


 




АА-МБА 60 - 0,8%, мл          



41,8


12,5


3,3     




1 M TRIS pH 8,8, мл           


36  


36  


-      




0,5 М TRIS pH 6,8, мл   
      


-  


-  


12,7     




10% SDS, мл                   


1  


1  


0,5     




H2O, мл                       


20,4


49,3


33,3     




TEMED, мкл                    



53  


53  


20       




10% ПСА, мкл                  



240  


240  


400       




 

Тяжелый и легкий растворы
смешивают, используя смеситель Gradient former Model 395 ("Bio-Rad",
США) или аналогичное отечественное оборудование, с тем, чтобы получить линейный
градиент концентрации акриламида в кассетах, которые постепенно заполняются с
помощью перистальтического насоса. Обычно, одномоментно заполняется 6 пластин,
что обеспечивает идентичность их изготовления и высокую воспроизводимость
полученных результатов. После заполнения на полимеризационную смесь наслаивают
воду. Полимеризация продолжается 30 - 40 мин. Затем воду удаляют, поверхность
геля промокают фильтровальной бумагой и заливают раствор, формирующий
концентрирующий гель.

Для приготовления 50 мл
раствора концентрирующего геля необходимо смешать компоненты, указанные в
таблице, причем катализаторы (TEMED и ПСА) добавляют непосредственно перед
заливкой геля. Полимеризация заканчивается через 30 - 40 мин.

Удалив воду, на
поверхность концентрирующего геля накладывают гель первого направления и
заливают расплавленным агарозным гелем (раствор 2.7). С края каждой пластины
формируют "карман" для нанесения белков - маркеров. В течение 5 мин.
агарозный гель затвердевает, обеспечивая полный контакт геля первого
направления с гелевой пластиной, и кассету помещают в прибор для электрофореза.

Электрофорез проводят при
следующем режиме:

    сила тока                  
30 мА на одну пластину

    максимальное напряжение    
200 В

    максимальная мощность      
50 Вт.

Электрофорез заканчивают,
когда лидирующий краситель доходит до нижнего края разделяющего геля.

После завершения
фракционирования для детекции белков на гелевых пластинах используют
окрашивание кумасси R-250 и азотно - кислым серебром.

Окрашивание белков
кумасси R-250 проводится по методу Fairbanks [132] в растворе: 10-процентная
уксусная кислота, 25-процентный изопропанол, 0,05-процентный кумасси R-250.

Окрашивание осуществляют
на водяной бане в течение 15 мин. с последующей отмывкой не связавшегося
красителя 10-процентной уксусной кислотой.

Окраску азотно - кислым
серебром проводят в модификации Blum [133] с использованием следующих
реактивов:

раствор гипосульфита
натрия (Na2S2O3 x 5H2O) - 0,2 г/л;

раствор азотно - кислого
серебра на 200 мл - 0,4 г азотно - кислого серебра, 150 мкл формалина;

проявляющий раствор на
200 мл: Na2CO3 - 8 г, 4 мл раствора гипосульфита натрия, 100 мкл формалина.

Все процессы при
серебрении проводятся на шейкере и в пластиковых емкостях. Гель после
окрашивания кумасси R-250 отмывают от краски 10-процентной уксусной кислотой до
светлого фона. Затем три раза по 20 мин. выдерживают в 25-процентном
изопропаноле для удаления из геля SDS, после чего промывают дистиллированной
водой (20 сек.). Далее в течение 1 мин. гель инкубируют в растворе гипосульфита
и два раза по 20 сек. отмывают в дистиллированной воде. На следующей стадии
гель выдерживают в растворе азотно - кислого серебра 15 мин., после чего трижды
по 20 сек. промывают дистиллированной водой.

На завершающем этапе гель
помещают в проявляющий раствор и окрашивание прекращают промывкой большим
количеством воды, когда на геле перестают появляться новые пятна.

Фотографирование гелей
проводится во влажном состоянии на пленку высокой чувствительности (например,
Микрат 300). Гели для хранения высушиваются. Для этого их дегидратируют в
растворе, содержащем 3% глицерина и 50% этанола в течение 30 мин., затем плотно
фиксируют между двумя слоями целлофана и высушивают в натянутом виде при
комнатной температуре.

5.5.3. Определение
продукта экспрессии включенной вставки методом иммуноблоттинга.

Для проведения
иммуноблоттинга необходимо располагать соответствующими мышиными антителами
против кодируемого вставкой полипептида.

Для детектирования
белкового продукта функционирования вставки рекомендуется использовать коньюгат
против иммуноглобулинов мыши "Sigma" в разведении 1:1500 или коньюгат
против иммуноглобулинов мыши "Amersham" в разведении 1:600.

На первом этапе анализа
проводят электроперенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозный фильтр фирмы
"Schleicher and Schull" (Германия) по методу Towbin [135] с
использованием буферного раствора, включающего 20 мМ Трис, 0,192 М глицин,
20-процентный метанол, 0,1% SDS (pH 8,3 - 8,4). Электроперенос проводят в
специальной камере для вертикального электроблоттинга фирмы "BioRad"
(США) (или на другом аналогичном оборудовании) при величине напряжения 15 - 16
В и силе