перемешивают и инкубируют 20 - 30
мин. при 65 град. C.

3. Охлаждают до 4 град.
C, добавляют 0,3 мл 5 М ацетата калия, перемешивают в вортексе и центрифугируют
10 мин. при 15000 об./мин. на микрофуге при комнатной температуре.

4. К надосадку добавляют
1 мл смолы Wizard MaxiPreps (Promega, США) и инкубируют смесь 10 мин. при 25
град. C.

5. Затем прокачивают
полученную смесь сквозь мини-колонку Wizard (Promega, США), промывают 2 мл
80-процентного изопропанола, отжимают оставшийся в мини - колонке изопропанол
центрифугированием на микрофуге (15000 об./мин., 2 мин.).

6. Добавляют в
микроколонку 50 мкл дистиллированной воды, подогретой до 65 град. C.

7. Инкубируют мини -
колонку с водой 10 мин. при 65 град. C, и отжимают раствор ДНК в чистую
стерильную микроцентрифужную пробирку центрифугированием на микрофуге (15000
об./мин., 2 мин.).

В зависимости от
содержания ДНК в конкретном пищевом продукте на проведение единичной
полимеразно - цепной реакции в объеме 50 мкл требуется от 2 до 20 мкл
полученного препарата ДНК.

Образцы пищевых продуктов
с повышенным содержанием масла перед выделением ДНК требуется подвергнуть
дополнительной экстракции эмульсией хлороформа в воде.

Для этого 0,5 г
исследуемого продукта гомогенизируют в смеси 0,5 мл буфера А и 0,5 мл
хлороформа и инкубируют гомогенат 20 мин. при 56 град. C. Затем охлаждают его
до 4 град. C и центрифугируют 10 мин. при 15000 об./мин. на микрофуге при
комнатной температуре. Водную фазу собирают и переносят в чистую пробирку.
Далее продолжают, начиная с пункта 2 вышеизложенной методики.

 

Выбор праймеров для
проведения ПЦР

 

Для точного определения
наличия трансгенной ДНК фирмой - поставщиком должна быть представлена
информация о молекулярной структуре трансгенной вставки, а именно ее
нуклеотидная последовательность. Это требование вводится для того, чтобы можно
было точно идентифицировать наличие конкретной генетической конструкции. В
таком случае синтетические олигонуклеотиды для проведения ПЦР будут
синтезированы таким образом, чтобы выявить факт наличия кодирующей области
трансгена. Длина используемых при анализе специфических праймеров должна
составлять не менее 25 пар нуклеотидов с целью избежания появления в результате
ПЦР неспецифических продуктов реакции.

В случае, когда подобная
информация по каким-то причинам не может быть представлена (к примеру, фирма -
производитель продуктов питания является только переработчиком производимого
другой организацией трансгенного сырья), необходимо проводить проверку на
присутствие в выделяемой из тестируемой продукции ДНК набора стандартных кассет
экспрессии, применяемых в мировой практике для получения трансгенных растений.
К таковым относятся праймеры для выявления генов маркеров селективной
устойчивости (гены устойчивости к неомицину npt II и к гигромицину hph), а
также стандартно применяемых промотерных областей (промотер вируса цветной
капусты E35S и прочие).

 

Выбор условий проведения
ПЦР

 

Для анализа при помощи
стандартных праймеров используют общепринятые в мировой практике условия
проведения ПЦР.

Для случаев специфических
праймеров подбор условий проведения ПЦР осуществляется для каждого конкретного
случая отдельно.

 

Аппаратура, применяемая
при проведении ПЦР и анализе ее результатов

 

Анализ наличия
трансгенной вставки в ДНК, содержащейся в продуктах питания, осуществляется на
ДНК амплификаторах "АМПЛИ-4" производства фирмы "Биоком",
Москва. Термостатирование образцов осуществляется на сухих термостатах
"Термо 24-15" производства фирмы "Биоком", Москва. Для
проведения ПЦР используется термополимераза Taq производства фирмы
"Биоком", Москва. Анализ продуктов ПЦР производится при помощи
рестрикционного анализа этих продуктов путем электрофореза в агарозном геле и
последующего фотографирования полученной картины на трансиллюминаторе UVTI
производства фирмы "Биоком", Москва, на фотопленку "Микрат -
Изопан" при помощи фотоаппарата "Зенит" или в цифровом виде при
помощи цифрового фотоаппарата "Кодак-ДС 120".

Фотоотпечатки или
оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек на
дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний.

 

5.3.
ПЦР-идентификация близкородственных

штаммов
бактерий

 

В настоящее время методы
молекулярной биологии, основанные на применении полимеразной цепной реакции
(ПЦР) находят все более широкое применение в целях диагностики и экспресс - анализа
разнообразного биологического материала. Интенсивное развитие подобных методик
обусловлено очень высокой чувствительностью ПЦР, возможностью быстрого
получения результатов (в течение одного рабочего дня), низкой стоимостью
получаемых результатов (по сравнению с другими методиками) и технологичностью
(возможностью организации действующей рабочей группы практически в любых
условиях, вплоть до передвижной экспресс - лаборатории).

Другие молекулярно -
биологические методы либо требуют для своей реализации организации специально
оборудованных дорогостоящих лабораторий, либо дают результаты с низкой
достоверностью. Типичный пример невозможности достоверной идентификации -
филогенетический анализ близкородственных видов по нуклеотидной
последовательности гена 16SpPHK. Такой анализ является общепринятым для полного
описания новооткрытых видов бактерий, но дает результаты низкой надежности при
попытке различить близкородственные виды, как это имеет место в случае
идентификации промышленных штаммов Streptomyces или бацилл из группы
B.anthracis.

 

Метод
идентификации бактерий при помощи ПЦР

 

Выбор метода

 

Среди основанных на
применении ПЦР молекулярно - биологических методов исследования биоразнообразия
наиболее подходящим для целей идентификации бактерий является метод так
называемого DAF-PCR, разработанный Caetano - Annoles (Caetano - Annoles G,
Bassam В J, Gresshoff PM (1991) DNA amplification fingerprinting using very
short arbitrary oligonucleotide primers. Bio / Technology 9: 553 - 556). Что
касается других методов, то они либо требуют слишком обширной информации о
строении генома конкретного микроорганизма (прямое выявление штамм -
специфичных генов), либо дают неполную для идентификации близкородственных
видов информацию (RAPD-PCR, DALP-PCR), либо слишком сложны и дорогостоящи и не
могут быть рекомендованы для широкомасштабного применения (AFLP-PCR).
Единственным узким местом в DAF-PCR является выбор приемлемых для точной
идентификации коротких олигонуклеотидных праймеров.

 

Выбор праймеров

 

Разработанное в Центре
"Биоинженерия" РАН программное обеспечение для анализа нуклеотидной
последовательности полных геномных бактерий позволяет провести выбор
олигонуклеотидных праймеров для DAF-PCR, обеспечивающих уверенную идентификацию
бактерий на уровне штамма, что соответствует индивидуальным различиям для
человека и других высших эукариотов. Подобная работа проведена для
идентификации близкородственных бактерий из группы В. anthracis, для которых
идентификация при помощи стандартных методов (филогенетический анализ нуклеотидной
последовательности гена 16SpPHK) оказалась безуспешной.

 

Выбор условий проведения
ПЦР

 

Условия проведения
реакции определяют степень точности и воспроизводимости результатов и должны
проводиться для конкретной группы бактерий.

 

Создание электронной базы
данных

 

Для полной и надежной
идентификации конкретного микроорганизма необходимо создать электронную базу
данных о конкретной группе бактерий, в которую включаются сведения о
максимально возможном числе различных имеющихся в виде чистых культур или коллекции
типовых штаммов бактерий.

 

Выделение ДНК

 

Наиболее надежные
результаты в ПЦР дает ДНК, выделенная непосредственно перед постановкой реакции
из замороженной бактериальной пасты с применением смолы фирмы Promega (США) по
модифицированному нами методу Бирнобойма и Доли:

- 20 - 40 мкл оттаявшей
бактериальной массы суспендируют в 100 мкл буфера I (50 mM Tris HCl, pH 8,0, 5
mМ EDTA, 50 mkg/ml RNAse). К суспензии добавляют 120 мкл лизирующего буфера
(0,2 М NaOH, 1% SDS) и ожидают лизиса бактерий, видимого по возрастанию
вязкости суспензии. После этого комплекс бактериальных белков и обломков
клеточной стенки осаждают добавлением 100 мкл 2,55 М ацетата калия при
энергичном встряхивании на вортексе в течение 5 мин. Жесткое встряхивание на
вортексе необходимо для того, чтобы порвать длинную бактериальную ДНК, которая,
будучи прикреплена в нескольких точках к мембране, в противном случае выпадает
в осадок вместе с комплексом SDS-белок. Затем смесь центрифугируют на микрофуге
в течение 5 - 10 мин. Надосадок переносят в 1,5 мл пробирку для микрофуги,
содержащую 0,75 мл смолы "Wizard
PCR-Prep" или
"Wizard Mini Prep" фирмы Promega. Смесь тщательно перемешивают и прокачивают
сквозь мини-колонку, промывают осадок смолы в мини-колонке 2 мл 80%
изопропанола, центрифугируют в микрофуге 1 мин. при максимальных оборотах для
удаления остаточной жидкости и миниколонку помещают в стерильную 1,5 мл
пробирку для микрофуги, наносят в мини - колонку 50 мкл стерильной
бидистиллированной или деионизованной воды и прогревают пробирку с колонкой 5
мин. при 70 град. C. Затем мини - колонку в пробирке помещают в микрофугу и
центрифугируют 1 мин. при максимальной скорости для переноса раствора ДНК в
пробирку. Описанным способом получают порядка 5 мкг ДНК. Размер полученной ДНК
- от 3 до 15 т.п.н., что вполне достаточно для выделения 16S РНК, бактерий
(около 1500 п.н. при использовании пары праймеров 11F/1492R). При условии
использования стерильных растворов и посуды получаемая ДНК может храниться при
+4 град. C в течение полугода. Срок хранения препаратов ДНК при -20 град. C
превышает 2 года.

 

Используемые реактивы и
оборудование

 

ПЦР осуществляется на ДНК
амплификаторах "АМПЛИ-4" производства фирмы "Биоком",
Москва. Термостатирование образцов осуществляется на сухих термостатах
"Термо 24-15" производства фирмы "Биоком", Москва. Для
проведения ПЦР используется термополимераза Taq производства фирмы
"Биоком", Москва. Анализ продуктов ПЦР производится при помощи
рестрикционного анализа этих продуктов путем электрофореза в агарозном геле и
последующего фотографирования полученной картины на трансиллюминаторе UVT1
производства фирмы "Биоком", Москва, на фотопленку "Микрат -
"Изопан" при помощи фотоаппарата "Зенит" или в цифровом
виде при помощи цифрового фотоаппарата "Кодак-ДС 120". Фотоотпечатки
или оттиски, выполненные на лазерном принтере с разрешением не менее 600 точек
на дюйм, должны быть приложены к протоколу проведения испытаний.
Олигонуклеотидные праймеры синтезируются в Центре "Биоинженерия" РАН.

 

5.4.
Методы определения общих свойств

генетической
вставки

 

5.4.1. Выделение геномной
ДНК и проведение полимеразной цепной реакции. Для выделения геномной ДНК из
пробы продукта может применяться фенол - хлороформный или другой адекватный
метод [124]. Полученные препараты ДНК сохраняются при минус 70 град. C и
используются для анализа методом полимеразной цепной реакции (ПНР).
Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР могут быть предоставлены фирмой -
изготовителем продукции или могут синтезироваться по заказу в соответствии с
данными о структуре вставки.

5.4.2. При проведении ПЦР
используется Taq-ДНК-полимераза производства ИБХ РАН. В типичных экспериментах
полимеризационную смесь объемом 50 мкл составляют так, чтобы она содержала 350
нг геномной ДНК, 1,5 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов
(фирма MBI Fermentas Lithuania), 1 ед. Taq-полимеразы. Затем к
полимеризационной смеси добавляют 30 пкМ пары олигонуклеотидных праймеров в
буферном растворе следующего состава: 67 мМ Трис-HCl буфер (pH 8,0 при 25 град.
C), содержащий 16,6 мМ сульфат аммония, 67 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол,
6,7 мкМ ЭДТА и бычий сывороточный альбумин в концентрации 170 мкг/мл. Далее на
каждую пробу наслаивают по 50 мкл минерального масла и реакцию проводят по
программам, специально адаптированным для конкретных участков гена в
многоканальном амплификаторе ДНК "Термцик" производства АО
"ДНК-технология" (Москва).

При необходимости
возможно проведение мультиплексной ПЦР для анализа нескольких важных фрагментов
вставки.

Продукты амплификации
анализируют с помощью электрофореза в пластине 6-процентного полиакриламидного
геля (2,5 ч при 200 В). ДНК-маркерами служит стандартный набор фрагментов ДНК
плазмиды pBR322, полученный под действием рестриктазы Alu 1 (фирма MBI
Fermentas). Окрашивание фрагментов ДНК осуществляется этидиум бромидом. Анализ
результатов и фотографирование электрофореграммы осуществляют в условиях
ультрафиолетовой подсветки на трансиллюминаторе.

 

5.5.
Методы оценки функционирования вставки

 

5.5.1. Определение мРНК,
продуцируемой вставкой, которая введена в геном растения с помощью гнездовой
ПЦР.

Выделение препаратов
суммарной мРНК из образцов продукта гуанидин - тиоцианат - фенол - хлороформным
методом [125] и проведение последующих гнездовых ПЦР с декларированными
праймерами [126, 125]. Детектирование синтезированных кДНК электрофорезом в
полиакриламидном геле с окрашиванием этидиум бромидом [126].

5.5.2. Двумерный
электрофоретический анализ белков.

В работе используются
следующие реактивы: акриламид, метиленбисакриламид, агароза, трис, глицин,
додецилсульфат натрия, персульфат аммония, тритон X-100, дитиотриэтол, Амберлит
МВ-1, 2-меркаптоэтанол,