мистого этидия в 100 мл воды. Для визуализации
ДНК в агарозном геле используется раствор в концентрации 5 мкг/мл. Внимание!
Все манипуляции с бромистым этидием и его растворами проводить в перчатках.

 

Выделение ДНК из
растительной ткани

 

Для получения
растительной ткани семена, клубни или другой растительный материал проращивают
в контролируемых условиях до получения листьев или свежей растительной ткани.

Высечку листа, полученную
при закрытии крышки пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл или 10 - 14 мг ткани
(когда высечку получить сложно), интенсивно гомогенизируют в 400 мл
экстракционного буфера (необходимые растворы и реактивы) с помощью тефлонового
пестика.

Примечание. Для выделения
ДНК лучше брать молодые листья с мягкими тканями, без видимых следов поражения.
Тефлоновый пестик должен плотно прилегать к стенкам пробирки. Стараться
максимально минимизировать время гомогенизации. Гомогенизацию вести до
интенсивного окрашивания в зеленый цвет экстракционного буфера.

 

Пробирки с гомогенатом
встряхивать 5 сек. на Vortex.

Поместить пробирки в
ультратермостат и инкубировать при 65 град. C 15 мин., периодически перемешивая
содержимое пробирки мягким покачиванием.

Добавить в пробирки по
200 мкл 5 М ацетата калия (предварительно охлажденного в холодильнике) и
тщательно перемешать содержимое пробирок легким встряхиванием.

Инкубировать пробы на
ледяной бане 15 мин.

Центрифугировать пробы в
настольной центрифуге при 16000 g 20 мин. при комнатной температуре.

Осторожно отобрать 400
мкл супернатанта в чистые пробирки и осадить двумя объемами 96-процентного
этанола (охлажденного), осторожно перемешивая. На этом этапе можно наблюдать
образование маленькой "медузы" или мелко дисперсной взвеси. Оставить
пробирки на столе на 5 мин.

Центрифугировать пробы в
настольной центрифуге при 16000 g 10 мин. при комнатной температуре.

Осадок ДНК промыть
охлажденным при -20 град. C 70-процентным этанолом и центрифугировать, как это
указано в предыдущем пункте. Рекомендуем повторить эту процедуру еще раз.

Слить надосадочную
жидкость и с помощью микропипетки максимально удалить остатки жидкости из
пробирки.

Осадки ДНК подсушить,
открыв крышки пробирок.

Примечание. Старайтесь не
пересушить осадки ДНК, т.к. пересыхание ДНК приводит к плохой растворимости в
воде.

 

Растворить ДНК в 100 мкл
стерильной бидистиллированной и деионизированной воды.

Измерить концентрацию
ДНК.

 

Амплификация геномной ДНК

 

Амплификацию геномной ДНК
проводят в 25 мкл реакционной смеси (67 мМ Трис-HCl pH-8,8; 16 мМ (NH4)2SO4; 2
mМ MgCl2; 0,01% Tween-20; по 200 мМ каждого dNTP; 10 рМ/мл праймера; 25 мкг
геномной ДНК и 0,5 ед. Taq-полимеразы). Все компоненты, кроме ДНК, входят в
набор для амплификации фирмы Biomaster.

Стерильные пробирки типа
Eppendorf на 0,5 мл поместить в штатив и подписать.

В одной из пробирок
сформировать реакционную смесь, последовательно добавляя компоненты, как это
указано в примере.

 

Пример
составления реакционной смеси

 




Ингредиенты         


На одну пробу, мкл


На 7 проб, мкл




H2O                          



16,8       


117,6    




Реакционный буфер без        

MgCl2(10X)                   



2,5       



17,5    




MgCl2                        



1         


7      




Смесь dNTP's                 



2         


14      




Праймер (4 ОЕ/мл)            



0,5       


3,5    




Термостабильная ДНК полимераза
(4 Е/мл)                      


0,2       


1,4    




ДНК                          



2         


-      




 

Развести реакционную
смесь по соответствующим пробиркам.

Внести в пробирки
геномную ДНК и тщательно пипетировать для перемешивания пробы.

Поверх реакционной смеси
наслоить несколько капель минерального масла (около 17 мкл).

Для удаления пузырьков
воздуха пробирки центрифугировать в течение нескольких секунд в настольной
центрифуге и перенести пробы в штатив амплификатора ДНК.

Установить и запустить
следующую программу амплификации ДНК:

1 цикл: 94 град. C - 3
мин.; 36 град. C - 1,5 мин.; 72 град. C - 1,5 мин.; II.33 цикла: 94 град. C -
0,3 мин.; 36 град. C - 1,5 мин.; 72 град. C - 1,5 мин.; III - 1 цикл: 94 град.
C - 0,3 мин.; 36 град. C - 1,5 мин.; 72 град. C - 10 мин.

Примечание. Ввиду большой
чувствительности RAPD-анализа рекомендуем пользоваться только одним
амплификатором и только одним выбранным набором реактивов для амплификации ДНК.
Все реактивы для амплификации и препараты ДНК необходимо хранить в морозильной
камере при 20 град. C. Перемораживание (ниже -20 град. C) препарата
термостабильной ДНК-полимеразы приводит к потере ее активности.

 

Электрофорез в агарозном
геле и визуализация продуктов амплификации

 

Для приготовления
2-процентной агарозы необходимо к 1 г агарозы добавить 0,5X ТВЕ буфер до 50 мл
и тщательно перемешать. Колбу закрыть фольгой.

Колбу с агарозой
поместить в мини-автоклав или скороварку и автоклавировать 15 мин.

Расплавленную агарозу
охладить до 50 град. C и залить в подготовленную форму для геля, избегая
образования пузырьков в геле. Толщина геля должна быть 0,5 - 0,7 см.

Через 30 - 40 мин., когда
гель сформируется, удалить гребенку и перенести его в камеру для электрофореза,
предварительно заполненную буфером ТВЕ 0,5X. Гель должен быть полностью покрыт
буфером на 1 - 2 мм.

К 2 мкл буфера для
нанесения добавить 10 - 13 мкл реакционной смеси, содержащей продукты
амплификации ДНК, тщательно перемешать пипетированием и нанести в лунки
агарозного геля. В крайнюю лунку нанести маркер молекулярной массы.

Примечание. Обычно в
качестве маркера молекулярной массы используют ДНК фага ламбда, обработанную
рестриктазой Hind III и EcoR I или Pst I.

 

Электрофорез проводят при
50 В (5 В/см) пока бромфеноловый синий не дойдет до отметки 1 см от края геля.
Обычно электрофорез длится 3 - 3,5 часа.

Для визуализации
фрагментов амплифицированной ДНК гель помещают в раствор бромистого этидия (5
мкг/мл) и проводят окрашивание в течение 20 мин. на качалке.

Примечание. С раствором
бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в перчатках.

 

Чтобы снизить фоновую
флюоресценцию, вызываемую бромистым этидием, гель отмывают дважды
дистиллированной водой при постоянном покачивании.

Примечание. Длительная
отмывка геля может привести к исчезновению слабых зон и размыванию спектров
из-за диффузии.

 

Гель поместить на фильтр
трансиллюминатора и просмотреть в проходящем УФ свете через защитный экран и
специальные защитные очки. При необходимости RAPD спектры фотографируют через
оранжевый или красный светофильтр на пленку типа "Микрат". Фрагменты
амплифицированной ДНК после обработки этидиум бромидом будут флюоресцировать
под УФ оранжевым цветом.

 

Примеры
использования RAPD анализа для идентификации

генотипов
картофеля

 

В работе использованы 19
декамерных праймеров. Спектры амплифицированной ДНК картофеля имели большое
количество фрагментов различной длины. Анализ RAPD спектров сортов картофеля с
использованием праймера PtA-19 выявил значительный полиморфизм между видами
(рис. 1) <*>. Полученные данные свидетельствуют о существенной
внутрисортовой вариабельности некоторых старинных отечественных сортов. С
использованием ограниченного числа праймеров на различных сортах получены RAPD
спектры, специфичные для отдельного сорта. Анализ спектров ДНК позволяет
выявить незначительные различия между близкородственными сортами, даже те что
были получены как сомаклональные варианты одних и тех же родителей.

Основанная на ДНК анализе
идентификация может использоваться в тех случаях, когда сорта не могут быть
надежно различены по результатам белкового электрофореза, включая анализ во
всех стадиях развития растения.

Разработанный быстрый
метод для изоляции ДНК из глазков картофеля и RAPD методика помогают сократить
время и стоимость анализа. Идентификация сортов по анализу ДНК может быть сделана
менее чем за 24 ч.

Контроль соматических
модификаций в геноме размножаемого in vitro и трансформированного картофеля по
тем же праймерам доказал высокую эффективность анализа ДНК при идентификации
генотипов растений (рис. 2) <*>.

    --------------------------------

<*> Рисунки не
приводятся.

 

Заключение. Предлагаемый
микрометод выделения геномной ДНК из растительного материала для RAPD-анализа
является быстрым, экономичным, так как не требует дорогостоящего оборудования и
реактивов по сравнению с другими молекулярными методами оценки растительных
генотипов, а также простым в исполнении. Растительный материал может быть взят
как из поля, теплицы, так и выращен в лабораторных условиях. Данный микрометод
не требует больших количеств растительной ткани (1 - 20 мг), что является
большим преимуществом в сравнении с другими методами, так как позволяет
сохранить растение для дальнейшей работы. Перечисленные достоинства этого
метода делают его очень удобным при работе с большим количеством проб при
массовом анализе, а также при изучении отдельных генотипов растений.

 

5.2.
Определение наличия трансгенной ДНК

в готовых
продуктах питания

 

Стандартно принятыми
методами для определения наличия чужеродного генетического материала и его
продуктов являются иммунологический анализ и выявление трансгенной ДНК при
помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). В случае исследования пищевых
продуктов, при изготовлении которых исходное сельскохозяйственное сырье
подвергается температурной обработке, иммунологический анализ может давать
нестабильные и плохо воспроизводимые результаты, поскольку денатурированные
белки часто не способны вступать в специфические реакции с антителами к
нативному белку.

Полимеразно - цепная
реакция в этом смысле обладает тем преимуществом, что температурная обработка
сырья не влияет на качество ДНК как матрицы и поэтому содержащаяся в продуктах
питания и полуфабрикатах остаточная ДНК исходного сырья при проведении ПЦР дает
такие же результаты, как и нативная ДНК. Вторым критерием в пользу выбора ПЦР как
метода анализа является высокая чувствительность метода, превосходящая как
минимум на два порядка чувствительность известных иммунологических методов.
Помимо этого, ПЦР является гораздо менее дорогим и более стабильным методом,
чем другие методы анализа. Еще одним немаловажным достоинством ПЦР является то,
что используемые в реакции синтетические олигонуклеотиды при правильном их
выборе могут быть применены для проведения анализов различных трансгенов, что в
случае иммунологических методов невозможно.

 

Методы
определения наличия трансгенной ДНК

в готовых
продуктах питания при помощи полимеразной

цепной
реакции

 

Выделение ДНК из
тестируемого продукта

 

В выборе метода выделения
ДНК определяющую роль играет содержание масла в продуктах питания. При
повышенном содержании масла (шоколад, нерафинированное растительное масло и
пр.) проводится дополнительная экстракция суспензией неполярных растворителей с
водой. Это позволяет перевести содержащуюся в пищевом продукте ДНК в водную
фазу, в которой и производится дальнейшая очистка. Для окончательной очистки
используется оригинальная методика, разработанная в центре
"Биоинженерия".

Обычная длина ПЦР
фрагмента при выявлении трансгенной ДНК не превышает 1000 пар оснований,
поэтому в основу нижеследующих методик легли процедуры выделения и очистки,
позволяющие получить достаточно чистые препараты ДНК для проведения ПЦР. Вторым
критерием отбора методик явилось требование минимизации времени, затрачиваемого
на выделение одного препарата ДНК.

 

Методика

 

1. 0,5 г образца пищевого
продукта гомогенизируют при помощи стеклянного или тефлонового пестика в 0,5 мл
буфера А (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mМ EDTA, 500 mМ NaCl, 10 mМ бета -
меркаптоэтанола).

2. После гомогенизации
добавляют 100 мкл 20% SDS. Смесь тщательно