вания резцов, покрытия шерстью,
пол животных [100]. Наблюдения за потомством осуществляют ежедневно.
Рассчитывают выживаемость потомства на 30-ый день.

 

7.4.2.
Исследование возможного мутагенного действия

 

Выявление мутагенного
действия испытуемых продуктов на соматических и половых клетках проводится на
лабораторных животных, а изучение генных мутаций на микроорганизмах или
дрозофиле.

Продукт скармливается
лабораторным животным в различных количествах в качестве составной части диеты
в разные сроки в зависимости от характера опыта.

На подопытных и
контрольных животных проводятся исследования:

- цитогенетические
исследования метафазным методом в соматических клетках (костный мозг, лимфоциты
крови животных);

- изучение генетических
изменений в половых клетках методом выявления доминантных летальных мутаций;

- изучение генных мутаций
производится по выбору на микроорганизмах или дрозофиле; микробиологические
методы используются для первичной оценки на мутагенность. Для этих целей чаще
всего используют штаммы микроорганизмов Salmonella thyphimurium [140 - 142].

В зависимости от
характера опыта используются следующие животные:

- линейные мыши (С57 В1/6
или другие чувствительные к мутагенам), самцы, вес 18 - 20 г;

- гибридные мыши, самки,
вес 18 - 20 г.

Для оценки мутагенного
действия испытуемого продукта изучают хромосомные аберрации в клетках костного
мозга и доминантные летальные мутации (ДЛМ) в половых клетках подопытных и
контрольных животных. Цитогенетические исследования проводят метафазным
методом. Согласно методу животных, получавших испытуемый и контрольный продукт,
через 24 часа после последнего скармливания забивают (предварительно за 2 часа
до забоя вводят внутрибрюшинно колхицин для накопления метафаз) и берут костный
мозг из 2-х бедренных костей. После гипотенизации клеток в термостате с помощью
0,5-процентного раствора KCl и фиксации смесью этанол + уксусная кислота
готовят цитогенетические препараты. От каждого животного анализируют 70 - 100
клеток на стадии метафазы деления ядра. В опытах используют мышей - самцов
линии С57 В1/6 в возрасте 2 месяца, весом около 20 г. Считается, что животные
этой линии наиболее чувствительны к мутагенам [101].

Генетические изменения в
половых клетках изучают методом выявления доминантных летальных мутаций у мышей
- самцов С57 В1/6 [101 - 102]. Проведение эксперимента сводится к следующему:
подопытным и контрольным животным скармливают испытуемый продукт в течение 30
дней. После периода скармливания 15 подопытных и 13 контрольных самцов
ссаживают с интактными виргинными самками линии СВА в соотношении 1:2 с целью
их скрещивания. Подсадка самок к подопытным самцам производится еженедельно на
протяжении 3-х недель, что дает возможность оценить действие испытуемого
продукта на половые клетки в постмейотическом периоде - сперматиды и зрелые
спермии. Отсаженных беременных самок убивают методом смещения шейных позвонков
на 15 - 17 день беременности, вскрывают, подсчитывают число желтых тел,
количество живых и мертвых эмбрионов. По этим данным рассчитывают индексы
мутагенности: доимплантационную, постимплантационную смертность, индуцированную
летальность.

В случае необходимости
рекомендуется проводить исследования на генные мутации на дрозофиле или
микроорганизмах.

Метод исследования генных
мутаций в зародышевых клетках дрозофилы, основанный на определении в
х-хромосоме самцов дикого типа (Д 32) рецессивных летальных мутаций,
передающихся через дочерей самкам второго поколения [103 - 104].

Метод выявления на
микроорганизмах мутагенной активности трансгенного продукта, подвергнутого
метаболическим процессам в организме млекопитающих (тест Эймса и метод
промежуточного хозяина) [105 - 106].

 

7.4.3.
Оценка потенциальной аллергенности пищевых

продуктов,
получаемых из генетически

модифицированных
источников

 

Для оценки потенциальной
аллергенности продукции, получаемой из генетически модифицированных источников
в Институте питания РАМН, разработана экспериментальная модель системной
анафилаксии, возникающей у лабораторных животных (крыс) при их внутрибрюшинной
сенсибилизации с последующим введением разрешающей дозы гомологичного белкового
антигена внутривенно.

Метод исследования
заключается в количественной оценке изменений тяжести протекания системной
анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов JgG1 +
JgG4) у крыс, получающих в составе рациона тестируемый продукт, полученный из
генетически модифицированных источников, в сравнении с животными, получающими
аналогичный продукт, изготовленный из традиционных источников.

 

Принцип метода

 

Метод основан на
количественной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при
внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс самцов линии ВИСТАР пищевым
антигеном - овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в)
введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка
внутривенно.

Определение включает
следующие этапы:

- в/б сенсибилизация крыс
антигеном - ОВА, адсорбированном на корпускулярном носителе - гидроксиде
алюминия;

- одновременное с
процессом сенсибилизации кормление животных рационами, содержащими тестируемый
и контрольный продукт;

- взятие крови для
определения антител и в/в введение разрешающей дозы ОВА, количественная оценка
тяжести развивающегося анафилактического шока;

- иммуноферментное
определение уровней циркулирующих специфических антител к ОВА;

- математическая
обработка результатов исследования и составление заключения о потенциальной
аллергенности исследуемого продукта.

 

Животные

 

Исследования выполняют на
крысах самцах линии ВИСТАР с исходной массой 150 - 180 г. Животных содержат на
стандартном рационе вивария, не содержащем яичного белка, в течение 7 - 10 дней
перед началом эксперимента по 5 - 6 животных в клетке. Контролируют массу тела
крыс, отстающих в приросте массы тела в течение периода адаптации удаляют.

В течение периода
кормления экспериментальным рационом (всего 29 дней) животные получают в составе
рациона тестируемый и контрольный продукт в квоте, не превышающей 20% общей
калорийности рациона.

Формируют 2 группы крыс
по 25 животных в каждой. Животные 1-й группы получают тестируемый продукт, а
животные 2-й группы - контрольный продукт в составе своих рационов. На 1-й,
3-й, 45-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют ОВА, а на 21-й день эксперимента
вводят дополнительную ("бустерную") дозу антигена, уменьшенную в 10
раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го
дня эксперимента. Далее крыс помещают в домики для в/в манипуляций и вводят
раствор ОВА в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся
реакции анафилаксии. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс
отбирают 0,1 - 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня
специфических антител.

Примечание. В случае,
если тестируемые продукты имеют жидкую консистенцию (молочные продукты,
напитки), вместо добавления в диету допускается вводить их животным ежедневно
внутрижелудочно через зонд, снабженный гладкой оливой диаметром не более 2 мм.

 

Материалы и оборудование

 

Овальбумин куриного яйца,
ОВА, 5-кратно перекристаллизованный лиофилизированный препарат.

Раствор хлорида натрия
0,15 моль/л (физиологический раствор).

Шприц инъекционный
"Рекорд" на 1,0 мл с иглой для в/б инъекций.

Шприц инъекционный
"Рекорд" на 20 мл с зондом для в/ж введения.

Алюмокалиевые квасцы
K[Al(SO4)2] x 12H2O, препарат квалификации ч.д.а.

Гидроксид натрия NaOH,
препарат квалификации ч.д.а.

Центрифуга лабораторная с
горизонтальным ротором ОПН-3.

Универсальный индикатор.

Домики для в/в
манипуляций на крысах, из оргстекла или дерева.

Шприц инъекционный
"туберкулиновый" с иглой для в/в введений.

Комплект реактивов и
оборудования для иммуноферментного анализа.

 

Приготовление антигена и
сенсибилизация

 

Навеску 10 мг ОВА
растворяют в 1,0 мл физиологического раствора (ФР) и добавляют 1,0 мл
10-процентного водного раствора алюмокалиевых квасцов. На этой стадии раствор
должен оставаться прозрачным. После этого добавляют по каплям при перемешивании
0,6 мл водного раствора NaOH 1 моль/л до образования плотного белого осадка.
Проверяют pH по универсальному индикатору: pH = 5 +/- 1. Осадок отделяют
центрифугированием 5 мин. при 3000 об./мин. Супернатант декантируют, а осадок промывают
10 мл ФР. Центрифугирование и промывку повторяют 3 раза. Окончательно осадок
гидроксида алюминия с адсорбированным ОВА диспергируют в 20 мл ФР.

Полученную дисперсию
антигена вводят крысам строго внутрибрюшинно в количестве 0,2 мл (по 100 мкг
ОВА в 1 дозе).

Для проведения
"бустерной" инъекции готовят антиген по той же схеме, за исключением
того, что исходная навеска ОВА уменьшается в 10 раз (1,0 мг).

 

Введение разрешающей дозы
и оценка тяжести реакции системной анафилаксии

 

Перед введением
разрешающей дозы ОВА крыс помещают в домики для в/в манипуляций. Хвост
животного погружают на 10 - 15 мин. в воду с температурой 37 +/- 1 град. C.

С помощью иглы для в/в
введений и шприца типа "туберкулиновый" отбирают 0,2 - 0,3 мл крови
для определения антител. После этого строго в/в вводят разрешающую дозу 5 мг
ОВА в 0,5 мл ФР (10 мг/мл ОВА). Внимание! Подкожное попадание раствора белка не
допускается!

Симптомы системной
анафилаксии развиваются у крыс, обычно, на протяжении первых 2 - 5 мин. после
введения разрешающей дозы. Тяжесть реакции оценивают в баллах в соответствии со
шкалой (см. таблицу).

 




Тяжесть реакции (баллы)


Симптоматика             





0          


отсутствует                            




1          


вялость, озноб, одышка                 




2           


атаксия, цианоз, парез задних          
конечностей                            





3          


судороги, паралич                      




4          


летальный исход                        




 

Окончательный подсчет
числа летальных исходов осуществляют на протяжении первых 24 часов после
введения разрешающей дозы.

 

Иммуноферментное
определение специфических антител

 

В основу метода анализа
антител к ОВА у крыс положен принцип непрямого твердофазного иммуноферментного
теста на полистероле (indirect ELISA).

В лунки полистерольных
планшет вносят по 1,0 мкг ОВА в 0,1М Na-бикарбонатном буфере pH 9,7 +/- 0,1 и
оставляют на 16 ч в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляют
путем промывки 0,01М Na-фосфатным буфером pH 7,3 +/- 0,1 с 0,15М NaCl и 0,1%
Твин-20 (Твин-PBS). В лунки на 30 мин. вносят по 200 мкл 1-процентного раствора
желатины в Твин-PBS. Отмывку повторяют, после чего вносят в лунки по 100 мкл
стандартов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии,
или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1:2000. Разведения выполняют
на PBS с 0,2-процентного бычьего сывороточного альбумина (DSA-PBS). Планшеты
инкубируют 90 мин. при 22 град. C со встряхиванием, после чего 5-кратно
отмывают Твин-PBS и вносят по 100 мкл кроличьих антител к JgG крысы,
коньюгированных с пероксидазой, в разведении 1:1000 в BSA-PBS. Инкубацию и
отмывку повторяют, после чего проводят реакцию со 100 мкл субстрата
0,04-процентного о-фенилендиамина и 0,04-процентного H2O2 в 0,1 М Na-цитрат -
фосфатном буфере pH 6,00 +/- 0,05 в течение 10 мин. при 37 град. C. Реакцию
останавливают добавлением 100 мкл 1 М H2SO4. Оптическую плотность измеряют при
длине волны 492 нм на фотометре АКИ-Ц-01.

Концентрацию антител
определяют по стандартному графику в полулогарифмических координатах методом
линейной интерполяции на ЭВМ.

 

Математическая обработка
результатов эксперимента и оценка результата

 

Тяжесть реакции
анафилактического шока в каждой из групп животных оценивают следующими
показателями:

- процентом летальных реакций
анафилаксии;

- анафилактическим
индексом, рассчитанным по формуле:

 

                                      N

                      АИ = (1 / N) x SUM ri,

 

где

N - число крыс в группе;

i - номер крысы;

r - тяжесть реакции
анафилаксии в баллах.

Достоверность различия
тяжести реакции анафилаксии между двумя группами определяют в соответствии с
U-тестом углового преображения Фишера. Для этого для каждого из указанных
безразмерных показателей (выраженных в долях единицы) рассчитывают
преобразованную долю выработки по формуле:

 

                                        __

                      фи = 2 x arcsin \/p ,