тели иммунной

системы интактных мышей

 

а. Определение влияния БАД на неспецифическую резистентность
мышей к бактериальной инфекции.

Мышам вводят перорально и внутривенно БАД в трех дозах. Контролем
служат мыши, не получавшие БАД. На каждую дозу берут по 10 мышей. Через 24 ч
всех мышей внутрибрюшинно заражают штаммом S.tiphi 4446, ресуспендированным в
0,5%-ном муцине или используют любую другую инфекционную модель. Заражающая
доза равна 100 LD50, оттитрованная на интактных мышах предварительно. Гибель
животных учитывается в течение 5 сут. Параллельно ставят контроль вирулентности
используемого штамма. Через 5 сут. подсчитывают ЕД-50 по формуле Кебера
(Ашмарин И.Л., Воробьев А.А., 1962) или любым другим статистическим методом.

Статистически значимое уменьшение значения ЕД-50 в опытных
группах свидетельствует о стимулирующем действии БАД, увеличение - о
супрессивном.

б. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к
корпускулярному тимусзависимому антигену.

Для определение антител в сыворотке крови мышей используют
эритроциты барана. Иммунизируют мышей 2-х линий: С57В1 - низкореагирующие на
эритроциты барана и мышей линии СВА - высокореагирующие. Опытную группу мышей
(5 мышей) внутрибрюшинно иммунизируют 0,5 мл эритроцитами барана (концентрация
20 млн. кл/мл). Эритроциты барана предварительно 3 раза отмывают 0,9%-ным
раствором хлорида натрия путем центрифугирования 7 мин. при 400 g и доводят до
концентрации 50 млн. кл/мл. Одновременно этой же группе животных вводят
исследуемую добавку к пище в трех дозах. Контролем служат две группы мышей:
одна группа - интактные мыши, другая - иммунизирована только эритроцитами
барана. Через равные промежутки времени, начиная с 4-го дня после введения
препаратов, у каждой мыши берут кровь из ретроорбитального пространства. Срок
исследования - не менее 21 дня. Из крови мышей получают сыворотку, которую
титруют в реакции прямой гемагглютинации общепринятым методом.

Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в
сыворотке крови опытной группы мышей. Увеличение титров гемагглютиногенов в
сыворотке крови опытной группы мышей свидетельствует о стимулирующем действии
БАД.

в. Определение уровня антител в сыворотке крови мышей к
растворимому тимусзависимому антигену.

В качестве растворимого тимусзависимого антигена используют бычий
сывороточный альбумин (БСА).

Мышей иммунизируют БСА дозой 50 мкг в 0,5 мл 0,9%-ного раствора
хлорида натрия внутрибрюшинно. Исследуемые продукты вводят в трех дозах
одновременно с БСА или за 30 мин. до иммунизации БСА. Контролем служат две
группы мышей: одна группа получает только БСА (без БАД), другая - интактная.

На 28 день после иммунизации проводится ревакцинация мышей той же
дозой БСА и берется кровь у мышей на 7, 14 и 21 дни после ревакцинации.
Получают сыворотку крови и исследуют ее в реакции РПГА на наличие
гемагглютининов к БСА общепринятым методом.

Для постановки РПГА готовят эритроцитарный диагностикум.
Формалинизированные эритроциты в 50%-ной концентрации трехкратно отмывают
0,9%-ным физиологическим раствором центрифугированием при 400 g 10 мин. После чего
концентрация эритроцитов доводится до 2,5%.

На 1000 мл диагностикума берется 50 мг танина, 2 л буфера pH 7,2
(фосфатного), все смешивается и энергично встряхивается 10 мин. После чего
производится осаждение и двукратное отмывание эритроцитов на центрифуге при том
же режиме. Ресуспензируют фосфатным буфером (pH 6,4) до 1 л. Затем на 1000 мл
эритроцитов (2,5%) добавляют 250 мг БСА, перемешивают и помещают в термостат на
24 ч при 37 °C, перемешивают не менее 5 раз. После инкубирования добавляют 10
мл формалина, перемешивают и помещают в термостат на 30 мин. После этой
процедуры отмывают физиологическим раствором (pH 7,2) два раза, затем
ресуспензируют буфером pH 7,2 с добавлением формалина так, чтобы в конечном
продукте содержалось 2,5% эритроцитов и 1% формалина. Для постановки реакции
обязательно применяется 0,9%-ный физиологический раствор, содержащий 1%
формалина.

Подсчитывают среднеарифметическую титра гемагглютиногенов в
группе и определяют их разницу по критерию Стьюдента.

Увеличение титров антител в опытных группах свидетельствует о
стимулирующем действии их проявления вторичного иммунного ответа БАД.

г. Определение поликлональной активности B-лимфоцитов.

Активность B-лимфоцитов определяется на модели подсчета
спонтанных "фоновых" клеток селезенки мышей, продуцирующих антитела к
эритроцитам барана (АОК) методом локального гемолиза эритроцитов в геле.
Опытной группе мышей двух линий (по три мыши) вводят БАД. На 5 - 7 день мышей
забивают, извлекают селезенки и готовят взвесь спленоцитов (концентрация 100
млн. кл/мл). Эритроциты барана отмывают 0,9%-ным раствором хлорида натрия путем
центрифугирования 7 мин. при 400 g три раза. Приготавливают 0,9%-ный раствор
агара "Дифко" с раствором Хенкса, доводят pH раствора до 7,2 1%-ным
раствором КН РО или NaOH по цвету индикатора, находящегося в растворе Хенкса.
Для приготовления 10 чашек Петри необходимо 225 мг агара, 22,5 мл
дистиллированной воды и 2,5 мл раствора Хенкса. К приготовленному раствору
агара добавляют отмытые эритроциты барана из расчета получаемой концентрации
эритроцитов 20 - 30 млн. в 1 мл.

Полученную рабочую смесь разливают по 2,5 мл в пробирки, которые
помещают в водяную баню при температуре 43 - 44 °C. В каждую пробирку добавляют
по 0,2 мл взвеси исследуемых клеток селезенки, перемешивают и выливают на чашку
Петри. Через 5 - 7 мин. чашки помещают в термостат при температуре (37 +/- 2)
°C на 1 ч, затем в каждую чашку выливают по 2,5 мл разведенного в 5 раз средой
199 сухого комплемента морской свинки (при использовании свежезамороженного
комплемента его разводят в 10 раз). Чашки Петри оставляют при комнатной
температуре на 30 мин. и затем подсчитывают макроскопически число зон гемолиза
в каждой чашке Петри. Рассчитывают число клеток, образующих антитела на
селезенку и на 1 млн. ядросодержащих клеток селезенки.

Полученные результаты в опытных группах сравнивают с контролем
(группа мышей, не получавшая БАД). Увеличение количества АОК после введения БАД
свидетельствует о поликлональной активности B-лимфоцитов.

д. Определение гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к
эритроцитам барана.

Мышей одного веса, одной линии разделяют на 2 группы. Опытной
группе мышей вводят подкожно в межлопаточную область эритроциты барана в дозе
10 млн. клеток на одну мышь в объеме 0,1 мл. Одновременно "per os"
этим же мышам вводят БАД. Вторая группа мышей - интактная. На 5 день всем мышам
обеих групп в подушечку одной задней лапки вводят разрешающую дозу эритроцитов
барана в концентрации 1 млрд. кл/мышь в объеме 0,02 мл. В контрлатеральную
подушечку лапки в том же объеме - 0,9%-ный раствор хлорида натрия. Местную
воспалительную реакцию оценивают через 18 - 20 ч путем определения веса опытной
(Ро) и контрольной (Рк) лапок мышей. Забивают мышей хлороформом. Отделяют лапки
по выступу кости ниже сочленения большеберцовой кости и выше пяточного сустава.

Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР),
рассчитываемому по формуле:

 

                   ИР = (Ро - Рк) : Рк x 100%.

 

Препарат, влияющий на клеточное звено иммунитета, вызывает
изменение индекса реакции.

е. Определение фагоцитарной активности макрофагов под влиянием
БАД.

Опытной группе (3 - 5 мышей) вводят БАД в дозе, оптимальной для
человека. Контролем служат интактные животные. От забитых животных получают
перитонеальный эксудат (ПЭ) путем 2 - 3-кратного промывания брюшной полости
мышей средой 199, содержащей 5 ME гепарина в 1 мл. ПЭ собирают в центрифужные
пробирки, стоящие на льду. После центрифугирования ПЭ при 150 g в течение 10
мин. клетки ресуспендируют в среде 199 с 10%-ной сывороткой крупного рогатого
скота и антибиотиками (100 ед. в мл). Концентрацию клеток доводят до 2 млн.
кл/мл и разливают по 2 мл в чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки помещают в
термостат с содержанием 5% углекислого газа. Через 1 ч смывают неприлипшие
клетки раствором Хенкса, добавляют 2 мл среды 199 и помещают в термостат с
углекислым газом на 18 - 24 ч.

Объектом фагоцитоза могут служить эритроциты барана, лабораторные
штаммы Staphilococcus или любые другие микроорганизмы.

Суточные культуры живых или убитых прогреванием при температуре
(90 +/- 2) °C микроорганизмов отмывают не менее трех раз 0,9%-ным раствором
хлорида натрия. Определяют концентрацию суспензии микробных клеток по стандарту
оптической плотности. Суспензию клеток разводят средой 199 до концентрации 10 -
20 млрд. кл/мл.

Эритроциты барана отмывают 3-кратно 0,9%-ным раствором хлорида
натрия центрифугированием при 800 g 5 мин. и готовят 0,5%-ную взвесь
эритроцитов в среде 199. Наливают 1 мл среды 199 в чашки Петри с клетками ПЭ,
затем вносят 1 мл взвеси эритроцитов барана или микроорганизмов. Через 30 - 60
мин. в чашки Петри наливают холодный раствор Хенкса и тут же выливают,
высушивают и фиксируют клетки метанолом. Затем клетки окрашивают азур - эозином
по Романовскому - Гимзе.

При учете результатов необходимо просмотреть под микроскопом не
менее 200 клеток, подсчитывают фагоцитирующие клетки и количество эритроцитов
или микробов в одном макрофаге.

Подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарное число.

Результаты, полученные в опытной группе, сравнивают с контролем.

ж. Оценка влияния БАД на продукцию растворимых медиаторов
иммуногенеза - цитокинов.

Для определения продукции цитокинов клетки селезенки (КС) мыши
инкубируют в течение: 12 - 14 ч в присутствии ЛПС для инициации синтеза ФНО-,
24 ч в присутствии конканавалина А (Кон А) или фитогемагглютинина (ФГА) для
инициации синтеза ИЛ-2. Количественное содержание цитокинов оценивают в
надосадочных жидкостях при помощи цитокин - зависимых или цитокин -
чувствительных клеточных линий.

з. Определение ФНО-.

Содержание ФНО- в исследуемых образцах надосадочной жидкости (НЖ)
КС мыши определяют по прямому лизису клеток ФНО-зависимой клеточной линии L-929
(фибробласты мыши) в присутствии актиномицина D (148). Клетки пересевают по 2030
тыс./лунка в плоскодонные 96-луночные планшеты в среде 199 с добавлением 5%
инактивированной при 56 °C сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубируют
24 ч при 37 °C. Образцы НЖ вносят в микропласты в разведениях 1:2 - 1:16 и
инкубируют при 37 °C в течение 16 - 20 ч. Результаты реакции учитывают после
окрашивания клеток 0,2%-ным раствором кристалл - виолета в 2%-ном этаноле в
течение 12 мин. Оптическую плотность слоя выживших окрашенных клеток измеряют
при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом (Multiscan,
Великобритания). В качестве стандарта в данном тесте используют рекомбинантный
ФНО-. Количество ФНО- в НЖ оценивают в пкг/мл, используя калибровочные кривые,
полученные при использовании стандарта.

и. Определение ИЛ-2.

    При определении ИЛ-2 КС мыши культивируют в концентрации  5  x

  6

10 /мл  в присутствии 5 мкг/мл Кон А в среде
RPMI-1640, содержащей

2%  сыворотки АВ в течение 
20  -  24  ч.  Содержание 
ИЛ-2  в  НЖ

определяют   по 
способности  образцов  поддерживать  пролиферацию

ИЛ-зависимой цитотоксической
клеточной линии.

CTLL-2 (лимфоциты мыши), оцениваемую по включению Н-тимидина в
ДНК клеток. Уровень включения радиоактивной метки определяют с помощью
сцинтилляционного бета - спектрометра. В качестве контроля используют раствор
рекомбинантного ИЛ-2 с известной активностью. Количество ИЛ-2 в НЖ оценивают в
МЕ/мл, используя калибровочные кривые, полученные при использовании стандарта.

к. Оценка влияния БАД на пролиферацию Т-лимфоцитов при
циклоспорин - индуцированной иммунодепрессии.

    Мышей -   самцов   линии  
Balb/c   иммунизируют   внутривенно

                                              8

эритроцитами барана в
оптимальной дозе (5 x 10 ), с целью индукции

иммунодепрессии через 24 ч
вводят циклоспорин А 
внутрибрюшинно  в

дозе 100 мг/кг.  Через 4 ч - изучаемую БАД в различных
дозах,  еще

через 4 ч животных
забивают,  извлекают клетки
селезенки,  которые

культивируют   с  
Кон   А  (митогеном,  реализующим  свой 
эффект

преимущественно на Т-клетки)
в течение 72 ч.  Степень пролиферации

клеток  селезенки 
мыши  оценивают  по 
включению в ДНК лимфоцитов

тимидина,  меченного тритием, который вносят в культуру
за 4 - 6 ч

до  окончания  инкубации.  Количество включенного клетками изотопа

после соответствующей
обработки измеряют на сцинтилляционном 
бета

- счетчике (149).

    л. Оценка влияния БАД на гуморальный иммунный ответ.

    Мышей - самцов 
Balb/c  иммунизируют
внутривенно  эритроцитами

                                 8

барана в оптимальной дозе (5
x 10 ), через 24 ч вводят циклоспорин

А   (мощный  
иммунодепрессант,   
оказывающий    свое    действие

преимущественно  путем ингибиции процессов активации
Т-лимфоцитов)

внутрибрюшинно в дозе 100
мг/кг,  еще через 4 ч - изучаемую
БАД  в

различных дозах
(рекомендуемая доза обязательна). На 4 сутки после

иммунизации определяют число
антителообразующих клеток в селезенке

мыши методом локального
гемолиза в агарозном  геле по Jerne
Nordin

(150).

 

Методы исследования аллергических свойств

биологически активных добавок к пище

 

1. Оценка влияния БАД на общую анафилактическую реакцию.

Морских свинок 200 - 250 г сенсибилизируют подкожно каким-либо
чужеродным белком. Наиболее удобно использовать нормальную лошадиную сыворотку
или бычий сывороточный альбумин в дозе 0,1 мл и 10 мг соответственно.
Одновременно свинкам вводят "per os" или внутримышечно исследуемую
субстанцию - это опытная группа животных. Контролем служит группа свинок, не
получавшая БАД. На 14 - 21 день пос