токсины.

 

7.5.1.
Сущность метода

 

Метод основан на способности
микроорганизмов из рода Staphylococcus расти на питательных средах с повышенным
содержанием поваренной соли. Наибольшее санитарно-гигиеническое значение имеет
Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), принадлежность к которому, в
основном, определяется по способности коагулировать цитратную плазму крови
человека или кролика.

 

7.5.2.
Аппаратура, материалы и реактивы

 

Аппаратура, материалы и
реактивы - согласно п.4.

 

7.5.3.
Подготовка к анализу

 

7.5.3.1. Подготовку проб и
приготовление разведений осуществляют как указано в п.п. 5.1; 5.2.

Посуду и материалы
стерилизуют как указано в п.5.3.

 

7.5.4.
Проведение анализа

 

При исследовании продуктов,
употребляемых без предварительной термической обработки после восстановления
(см. табл.1) навеска продукта должна составлять 10 г; для продуктов,
употребляемых с предварительной термической обработкой и компонентов - 1 г (см.
табл.1-9). Сухие молочные продукты типа "Детолакт", "Новолакт
ММ", "Новолакт-1" и т.п., восстанавливаемые перед употреблением
при (37±1)°С и (70±1)°С, подвергаются предварительной инкубации в фосфатном
буферном растворе перед посевом.

Остальные продукты и
компоненты, предусмотренные в табл.1-9, засевают без предварительной инкубации
непосредственно в питательную среду.

В случае выявления S. aureus
в готовых сухих молочных продуктах, компоненты, входящие в их состав,
исследуются на наличие S. aureus с предварительной инкубацией.

7.5.4.1. Взвешивают в
стерильных условиях 10, или 1 г продукта и помещают в колбы с 90,0 см3  или 9,0 см3  разбавленного фосфатного буфера.
Хорошо размешивают. Смесь выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С от
18 до 24 ч. На следующий день пипеткой переносят 1,0 см3  смеси в пробирку с солевым бульоном
(п.6.2.4.1) и помещают в термостат при температуре (37±1)°С на (24±1) ч.

Жидкие и пастообразные
продукты, подготовленные согласно п.5.1.5 и другие продукты, не подвергающиеся
предварительной инкубации, в количестве 1, или 10 г (см3) засевают в пробирки
или колбы с солевым бульоном при соотношении продукта и среды 1:10 и помещают в
термостат при температуре (37±1)°С.

7.5.4.2. Через (24±1) ч
производят пересев петлей из бульона для получения изолированных колоний на
чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер (п.6.2.4.3) или ЖСА
(желточно-солевой агар) (п.6.2.4.4). Чашки с посевами выдерживают в термостате
при температуре (37±1)°С от 18 до 48 ч.

S. aureus на среде
Байрд-Паркера растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний в диаметре
1-1,5 мм, окруженных зоной просветления среды, шириной 1-3 мм. Около 90% S.
aureus, выделенных из пищевых продуктов, и штаммы, образующие энтеротоксин, на
агаре типа Байрд-Паркер дают зоны просветления через (24±1) ч инкубации при
(37±1)°С. Эти колонии не требуют подтверждения в принадлежности к S. aureus и
подлежат учету через (24±1) ч инкубации.

На ЖСА колонии стафилококков
имеют форму выпуклых дисков диаметром 2-4 мм, белого, желтого, кремового,
лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется
радужное кольцо и зона помутнения среды.

Из характерных колоний,
подозрительных на стафилококки, готовят мазки-препараты, окрашивают по Граму и
микроскопируют. Колонии грамположительных мелких кокков, расположенных в мазке
гроздьевидно,отсеивают на сектора чашки Петри или в пробирки со скошенным
мясо-пептонным агаром (п.6.1.12), посевы выдерживают в термостате при (37±1)°С
от 18 до 24 ч. Из культур, выросших на МПА, после предварительной проверки
мазка на чистоту под микроскопом, ставят реакцию плазмокоагуляции.

7.5.4.3.
Постановка реакции плазмокоагуляции.

В пробирку с 0,5 см3  разведенной кроличьей плазмы вносят
петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой оставляют
незасеянной, а в другую засевают заведомо коагулазоположительный стафилококк в
качестве контроля. Пробирки помещают в термостат при температуре (37±1)°С.
Учитывают результаты через 2-4 часа и оставляют до утра при комнатной
температуре для окончательного учета. Ускорение реакции производят за счет
использования 3-х и 4-х часовых бульонных культур стафилококков, добавляя их по
0,1 см3  в 0,5 см3  разведенной цитратной плазмы.

Пробирки на свертывание
плазмы следует просматривать осторожно, чтобы не разрушить начало образования
сгустка.

При учете реакции
плазмокоагуляции могут наблюдаться три степени активности фермента коагулазы:

++++ - сгусток плотный;

+++ - сгусток, имеющий
небольшой отсек;

++ - сгусток в виде
взвешенного мешочка.

Все три варианта являются
положительным результатом.

 

7.5.5.
Обработка результатов

 

7.5.5.1. Положительная
реакция плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных
стафилококков в засеянной массе продукта (в 10, или в 1 г (см3).

7.5.5.2. Отрицательная
реакция плазмокоагуляции свидетельствует об отсутствии коагулазоположительных
стафилококков в засеянной массе продукта (в 10, или 1 г (см3).

Примечание.

При обнаружении значительного
роста коагулазоотрицательных стафилококков в готовых детских сухих молочных
смесях, микробиолог должен обратить внимание на санитарно-гигиеническое
содержание предприятия, т.к. у детей грудного возраста некоторые варианты
коагулазоотрицательных стафилококков (S. epidermidis) также способны вызывать
острые стафилококковые энтериты.

 

7.6.
Определение энтерококков

 

Определение энтерококков
проводят в случае обнаружения в выработанной партии значительного превышения
количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в
целях выяснения причин несоответствия изготовленного продукта этому нормативу.

 

7.6.1.
Сущность метода

 

Метод основан на
количественном подсчете колоний энтерококков, вырастающих на плотных
питательных средах, в состав которых входят ингибиторы (кристаллический
фиолетовый, трифенилтетразолий хлористый, антибиотики: пенициллин, стрептомицин,
полимиксин), подавляющие развитие других бактерий.

 

7.6.2.
Аппаратура, материалы, лабораторная посуда и реактивы

 

Аппаратура, материалы,
лабораторная посуда и реактивы - согласно п.4.

 

7.6.3.
Подготовка к анализу

 

Подготовку проб и
приготовление разведений проводят, как указано в п.5.1 и 5.2.

Посуду и материалы
стерилизуют, как указано в п.5.3.

 

7.6.4.
Проведение анализа

 

7.6.4.1.
Посев.

Берут по 0,1 см3  жидких продуктов или из первого
разведения сухих и пастообразных продуктов и высевают на подсушенную
поверхность молочной среды с полимиксином (п.5.2.5.1) в 2-х чашках Петри.
Посевной материал тщательно втирают шпателем в поверхность среды. Посевы
инкубируют при (37±1)° С в течение (48±1)ч.

7.6.4.2. Обработка
результатов.

Посевы просматривают.
Типичные колонии энтерококков имеют округлую форму, ровные края, блестящую
поверхность, диаметр 1,5-2 мм и красную окраску с зоной протеолиза на
светло-голубом фоне среды. Подсчитывают все типичные колонии на обеих чашках и
среднеарифметическое их число умножают на 10 или 100, соответственно, получая
количество энтерококков в 1 г или 1,0 см3 
продукта.

Идентификация культур.

Три-пять колоний отсеивают на
скошенный мясо-пептонный агар для дальнейшей идентификации. На скошенном агаре
посевы культивируют при (37±1)°С в течение (24±1) ч.

Из колоний, выросших на
скошенном агаре, готовят мазки и окрашивают по Граму. Определяют каталазную
активность культуры: на чистое обезжиренное стекло наносят каплю 1%-ного
водного раствора перекиси водорода (п.6.2.9.2) и в ней растирают петлю
культуры. Если пузырьки газа не выделяются, значит реакция отрицательная. Кроме
того, изучаемые культуры засевают в бульоны, содержащие 40% желчи (п.6.2.9.3) и
имеющие активную кислотность 9,6 ед рН (п.6.2.9.4). Инкубируют посевы при
(37±1)°С от 18 до 24 ч. Рост изучаемых культур в указанных бульонных средах
подтверждают микроскопией мазка, окрашенного но Граму.

Энтерококки -
грамположительные кокки, в мазках из жидких сред располагаются в виде коротких
или длинных цепочек, с плотных - в виде диплококков или скоплений кокков;
растут в бульонах с 40% желчи и при активной кислотности (9,9±0,3) ед рН, не
разлагают перекись водорода, так как не вырабатывают фермент каталазу.

Обнаружение значительного
роста энтерококков при посеве исследуемого материала свидетельствует о
необходимости контроля за термическим режимом технологического процесса или
проведения санитарной обработки оборудования и технологических линий.

 

7.7. Определение
В. cereus *(6)

 

В. cereus - аэробные
спорообразующие грамположительные палочки, часть штаммов способна продуцировать
энтеротоксин.

 

7.7.1.
Сущность метода

 

Метод основан на
количественном подсчете B.cereus, относящихся к спорообразующим аэробным бациллам,
при росте их на плотных питательных средах с антибиотиком и яичным желтком.

 

7.7.2.
Аппаратура, материалы и реактивы

 

Аппаратура, материалы и
реактивы - согласно п.4.

 

7.7.3.
Проведение анализа

 

7.7.3.1. Подготовку проб и
приготовление разведений проводят, как указано в п.5.1 и 5.2.

Посуду, материалы и реактивы
стерилизуют, как указано в п.5.3.

7.7.3.2.
Посев.

Производят посев по 0,1 см3  разведения сухих молочных продуктов
1:10 (0,01 г продукта), по 0,2 см3 
БАДов из разведения 1:10 (0,02 г продукта) на поверхность хорошо
подсушенной питательной среды в 2-х чашках Петри. Посевной материал тщательно
растирают шпателем. Для посева используют питательные среды по п.6.2.5.1 (среда
Донована) или п.6.2.5.3 (солевой полимиксиновый агар).

Посевы инкубируют в
термостате при температуре (37±1)°С от 24 до 96 ч.

7.7.3.3.
Обработка результатов.

При отсутствии роста на обеих
чашках дают заключение о соответствии детской сухой молочной смеси нормативу за
этот показатель. При обнаружении роста изучают морфологию колоний: штаммы В.
cereus на солевом полимиксиновом агаре с 2,3,5-трифенилтетраводном хлористым
образуют ярко-рубиновые колонии на фоне широкой зоны глубокого равномерного
коагулята, колонии в первые часы округлые, выпуклые; в дальнейшем (через 24-48
ч) - распластанные по поверхности агара с изрезанными краями. На среде Донована
штаммы B.cereus образуют крупные белые распластанные колонии со слегка
изрезанными краями, окруженные широкой зоной глубокого белого равномерного
матового коагулята или двойной зоной - коагулята и просветления (лецитиназная
активность).

Из типичных колоний готовят
мазки и окрашивают но Граму.

В. cereus - грамположительные
споровые палочки, в некоторых культурах - грамотрицательные.

7.7.3.4.
Идентификация культур.

Пересеивают 3-5 колоний на
скошенный агар с последующей инкубацией при температуре (30±1)°С от 18 до 24 ч.

Проводят микроскопию висячей
и раздавленной капли для установления подвижности и посев на среду с маннитом
(п.6.2.5.5) и на кровяной агар (п.6.2.5.4). Инкубацию посевов проводят при
(30±1)°С от 24 до 48 ч. Культуру также пересевают в пробирки со средой Кларка
(п.6.2.2.5), которую инкубируют при температуре (30±1)°С в течение (48±1) ч,
для последующей постановки реакции Фогес-Проскауэра.

Постановка реакции
Фогес-Проскауэра описана в п.7.3.5.4.

Характерными признаками для
В. cereus являются образование зон просветления на кровяном агаре
(гемолитическая активность), положительные реакции на лецитиназу и
Фогес-Проскауэра, подвижность и отсутствие способности сбраживать маннит.

7.7.3.5. При обнаружении
роста, для определения количества В. cereus в исследуемом продукте, количество
выросших типичных колоний на чашках умножают на соответствующее разведение и
выражают в пересчете на 1 г или 1,0 см3 
исследуемого продукта.

7.7.3.6. В продуктах,
выработанных с соблюдением технологических правил, при посеве 0,01 г рост В.
cereus должен отсутствовать, что соответствует показателю на этот микроорганизм
- "менее 100 клеток/г".

При обнаружении роста,
микробиолог в заключении указывает подсчитанное количество В. cereus в 1 г
продукта.

При несоответствии нормативу
только по B.cereus в сухих молочных продуктах типа "Детолакт" (в
отдельных случаях от 100 до 200 КОЕ/г), партия од