ции по ИМАЦ-тестам (реакция на
индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация
цитрата).

7.3.5.3.
Реакция на индол.

Из типичной изолированной
колонии на среде Эндо (Левина) производят высев в пробирку с бульоном на индол
(п.6.2.2.4). Пробирки выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в
течение (24±1) ч.

После выдерживания в
термостате, в пробирки с индольной средой добавляют 5-10 капель реактива Эрлиха
(п.6.2.2.14). Появление темно-красного окрашивания в поверхностном слое
свидетельствует об образовании индола.

7.3.5.4.
Реакция Фогес-Проскауэра.

Типичную, хорошо
изолированную колонию пересевают в пробирку со средой Кларка (п.6.2.2.5).
Выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (48±1) ч. Вынимают
пробирки из термостата и из каждой из них пипеткой стерильно отбирают 1,0 см3  культуральной жидкости в чистые
пробирки. Затем к 1,0 см3  добавляют
0,60 см3  5%-ного раствора
альфа-нафтола (п.6.2.2.11) и 0,20 см3 
40%-ного раствора гидроокиси калия (п.6.2.2.12), хорошо
перемешивают. Появление красного окрашивания свидетельствует о положительной
реакции (образование ацетилметилкарбинола).

7.3.5.5. Реакция с метиловым
красным.

В пробирки с оставшейся
культурой в среде Кларка добавляют по 5 капель реактива метилового красного
(п.6.2.2.7) в каждую пробирку. Четкое малиново-красное окрашивание указывает на
положительную реакцию.

7.3.5.6. Утилизация цитратов.

Производят пересев из
типичных колоний со среды Эндо или Левина на чашки Петри с подсушенной средой
Симмонса (или в пробирки со средой Козера (п.п.6.2.2.15, 6.2.2.16). Посевы
выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С от 24 до 48 ч. При учете
результатов обращают внимание на наличие роста и изменение окраски среды.

Наличие роста и изменение
цвета среды с зеленого в синий или желтый характерно для цитрат-положительных
культур.

Для цитрат-отрицательных
разновидностей характерно отсутствие роста и изменения цвета среды.

 

7.3.6.
Оценка результатов идентификации

 

Таблица 11

Классификация
колиформных бактерий по ИМАЦ-тестам

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


|Образование|Реакция
с|Реакция   |Утилизация | Тип
бактерий             |

| индола    |метиловым|Фогес-    |цитратов   |                         
|

|           |красным  |Проскауэра|          
|                          |

|———————————|—————————|——————————|———————————|——————————————————————————|

|    +     
|    +    |     -    |  
-       | Типичные Е. coli         |

|———————————|—————————|——————————|———————————|——————————————————————————|

|    -     
|    +    |     -    |  
-       | Атипичные Е. coli        |

|———————————|—————————|——————————|———————————|——————————————————————————|

|    -     
|    -    |     +    |  
+       | Типичные A.
aerogenes    |

|———————————|—————————|——————————|———————————|——————————————————————————|

|    +     
|    -    |     +    |  
+       | Атипичные A.
aerogenes   |

|———————————|—————————|——————————|———————————|——————————————————————————|

|    +     
|    +    |     -    |  
+       | Типичные
Citrobacter     |

|———————————|—————————|——————————|———————————|——————————————————————————|

|    -     
|    +    |     -    |  
+       | Атипичные
Citrobacter    |

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


 

При выделении из продукта
грамотрицательных неспорообразующих палочек, продуцирующих газ из лактозы при
(44±1)°С, образующих и не образующих индол, дающих положительную реакцию с
метиловым красным, отрицательную Фогес-Проскауэра и не растущих на среде
Симмонса (Козера) считают, что в 10 г продукта содержатся эшерихии коли.
Продукт в данном случае бракуется.

При обнаружении в 10 г
продукта бактерий родов Enterobacter и Citrobacter, но при отсутствии
колиформных бактерий (БГКП) в 1 г, продукт браковке не подлежит. Однако
микробиолог предприятия должен усилить контроль за соблюдением
санитарно-гигиенических правил на предприятии и обратить внимание на
необходимость дополнительного контроля технологических режимов при изготовлении
продукта.

 

7.4.
Определение сальмонелл

 

Сальмонеллы - обширный род
семейства энтеробактерий, включающий более 2000 серотипов, большинство которых
обладает патогенными свойствами. К сальмонеллам относятся аэробные и
факультативно-анаэробные грамотрицательные подвижные палочки, хорошо растущие
на обычных питательных средах и разнообразных пищевых субстратах.

 

7.4.1.
Сущность метода

 

Метод основан на
использовании сред обогащения для увеличения роста сальмонелл, их выделения на
специальных агаровых средах, с последующим проведением серологической реакции.

 

7.4.2.
Аппаратура, материалы, реактивы

 

Аппаратура, материалы,
реактивы - согласно п.4.

 

7.4.3.
Подготовка к анализу

 

7.4.3.1. Подготовку проб и
приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2. Посуду и
материалы стерилизуют, как указано в п.5.3.

 

7.4.4.
Проведение анализа

 

Для посева используют то
количество продукта, в котором регламентируется отсутствие бактерий рода
сальмонелла соответствующими пунктами таблиц 1-9.

Посев продуктов производится
с предварительной инкубацией в фосфатном буферном растворе.

Компоненты детских сухих
молочных продуктов засевают без предварительной инкубации непосредственно в
колбы со средой для селективного обогащения. В случае выявления бактерий рода
сальмонелла в готовых сухих молочных продуктах, компоненты, входящие в их
состав, повторно исследуются на наличие сальмонелл с предварительной инкубацией
продукта по п.7.4.4.1.

7.4.4.1.
Посев с предварительной инкубацией.

Взвешивают в стерильных
условиях в стакане продукт в количествах, предусмотренных в табл. NN 1-9, и
затем для предварительного обогащения навеску асептически переносят в колбу с
разбавленным фосфатным буфером (п.6.1.2). Соблюдают соотношение массы продукта
и буферного раствора 1:10. Проверяют рН с помощью индикаторной бумаги и доводят
активную кислотность смеси до (7,0±0,2) ед рН, 1Н раствором гидроокиси натрия.

Все тщательно перемешивают.
При плохом растворении продукта пробы подвергают механическому встряхиванию на
аппарате для встряхивания жидкости (шуттель-аппарат). К приготовленной взвеси
продукта добавляют 0,1%-ный водный раствор бриллиантового зеленого (п.6.2.2.9)
в количестве 2% к объему (т.е. 20 см3 
раствора красителя к 1000 см3  взвеси продукта), перемешивают и выдерживают и термостате
при при температуре (37±1)°С и от 18 до 24 ч.

На следующий день переносят
1,0 см3  выдержанной в
термостате смеси в пробирки с 10,0 см3 
магниевой среды (п.6.2.3.1) или среды Мюллера (п.6.2.3.3).
Пробирки помещают в термостат с температурой (37±1)°С от 18 до 24 ч.

7.4.4.2.
Прямой посев в среды для селективного обогащения.

Асептически взвешенные
навески сухих компонентов, стерильно отмеренные объемы жидких компонентов в
количествах, предусмотренных соответствующими графами табл.9, засевают в колбы
с магниевой средой или средой Мюллера, соблюдая соотношение продукта и среды не
менее 1:9.

Для жидких продуктов
допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиентов при
соотношении продукта и среды 1:1.

Колбы с посевами помещают в
термостат с температурой (37±1)°С от 18 до 24 ч.

7.4.4.3. После инкубации в
термостате производят высев из колб и пробирок с магниевой средой или средой
Мюллера на поверхность подсушенных чашек с дифференциально-диагностическими
средами Плоскирева и висмут-сульфитного агара. Для получения отдельных колоний
петлей берут минимальное количество посевного материала и производят посев
штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат с температурой (37±1)°С от 24 до
48 ч. Проверку посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 ч после инкубации в
термостате.

 

7.4.5.
Обработка результатов

 

7.4.5.1. На среде Плоскирева
колонии сальмонелл бесцветные, прозрачные, плоские, на висмут-сульфитном агаре
- черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с темным ободком,
при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных
колоний сальмонелл на каждой из сред конечный результат анализа записывают как
"отрицательный", т.е. в исследуемой массе продукта сальмонеллы
отсутствуют.

При наличии на любой из
питательных сред на чашках Петри типичных или подозрительных колоний на
сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение.

7.4.5.2. Из каждой среды на
чашке Петри, содержащей подозреваемую колонию сальмонелл *(5), выбирают хорошо
изолированную колонию и высевают штрихом и уколом на трехсахарный агар с
мочевиной (п.6.2.3.7) или среду Клиглера (п.6.2.3.10). Пробирки с посевами
выдерживают в термостате при (37±1)°С в течение (24±1) ч. Производят
идентификацию культур, высеянных на среду Клиглера или трехсахарный агар с
мочевиной по ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и расщеплению мочевины.

Покраснение или пожелтение (в
зависимости от добавленного индикатора) скошенной части столбика среды
указывает на образование кислоты в результате ферментации лактозы, сахарозы или
обоих cахаров. Покраснение самого столбика указывает на расщепление глюкозы.
Восстановление цвета среды до исходного (бледно-розовый) свидетельствует о
расщеплении мочевины.

Механизм действия среды
Клиглера идентичен с трехсахарным агаром. Об образовании сероводорода судят по
почернению среды в столбике. Если культуры сбраживают лактозу с образованием
газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелла.

Культуры, не ферментирующие
лактозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием
или без образования газа), подвергаются дальнейшему изучению.

Культуры, ферментирующие
глюкозу без образования газа, подозрительны как брюшнотифозные или
дизентерийные.

Культуры, ферментирующие
глюкозу с образованием газа, дающие в среде пузырьки и продуцирующие
сероводород, могут принадлежать к роду сальмонелла.

Если ни в одной из пробирок
не обнаружено ни одной характерной для сальмонелл реакции, то результат считают
отрицательным и дают заключение об отсутствии в исследуемой массе продукта
бактерий рода сальмонелл.

7.4.5.3. Определение
образования ацетилметилкарбинола проводят по п.7.3.5.4. Бактерии рода
Salmonella не образуют ацетилметилкарбинола (реакция Фогес-Проскауэра
отрицательная).

7.4.5.4. Если обе пробирки
покажут типичную для сальмонелл окраску сред, а выделенный штамм дает
отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра проводят серологическое исследование.
Для этой цели берут петлей небольшое количество культуры из пробирок с
трехсахарным агаром или средой Клиглера, эмульгируют в капле физиологического
раствора на предметном стекле. Добавляют каплю сальмонеллезной 0-сыворотки
(п.6.2.3.11) к раствору и осторожно покачивают предметное стекло, чтобы смешать
жидкости.

Положительная реакция на
сальмонеллы (агглютинация) наблюдается в течение 30-60 сек. Обязательна
постановка отрицательной реакции (культура + физиологический раствор). Если при
проведении серологического исследования агглютинации не обнаруживается,
конечный результат записывают как "отрицательный".

Любая агглютинация, которая
появляется на стекле, говорит о вероятности присутствия сальмонелл.

7.4.5.5. При выделении
культур грамотрицательных палочек, ферментирующих глюкозу с образованием или без
образования газа, не ферментирующих лактозу и сахарозу, образующих или не
образующих сероводород, дающих отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра и
обладающих четкой серологической характеристикой, считают, что в исследуемой
навеске продукта присутствуют бактерии рода сальмонелла. Продукт к реализации
не допускается. Проводится тщательная санитарная обработка всей технологической
линии, а при необходимости - контроль всех исходных компонентов продукта.

 

7.5.
Определение коагулазоположительных стафилококков (S. aureus)

 

S. aureus - аэробные
грамположительные сферические пигментообразующие микроорганизмы, обладающие
ферментом коагулазой, большая часть из которых способна продуцировать
энтеро