.10, 6.2.1.1, 6.2.1.2). Если ожидают ползучий рост микроорганизмов,
посевы заливают вторым слоем питательной среды или (4±1) см3  водного раствора агара (п.6.2.8.5).

Края колб с питательной
средой перед каждой заливкой фламбируют в пламени газовой горелки или
спиртовки. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно
перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного
распределения посевного материала.

 

7.1.4.
Инкубация

 

После застывания среды чашки
Петри переворачивают крышками вниз и помещают в таком виде в термостат при
(30±1)°С на 72 ч (допускается предварительный учет через (48±1) ч с последующим
окончательным учетом еще через (24±1)ч.

Чашки Петри с посевами
распределяют в термостате таким образом, чтобы каждая их группа отделялась от
соседних чашек, от верха и стенок термостата не менее, чем на 3 см.

 

7.1.5. Учет
и обработка результатов

 

Количество выросших колоний
подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь
лупой с увеличением от 4 до 10 раз. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне
чашки чернилами. При подсчете колоний рекомендуется пользоваться специальным
прибором.

При большом числе колоний и
равномерном их распределении дно чашки Петри делят на четыре и более одинаковых
сектора, подсчитывают число колоний на двух-трех секторах (но не менее, чем на
1/3 поверхности чашки), находят среднее арифметическое число колоний и умножают
на общее количество колоний, выросших на одной чашке.

Если инкубированные чашки с
разведением 1:10 не содержат колоний, то результат выражают так: меньше, чем
1х10(1) или менее 10 бактерий на 1,0 см3 
(г) продукта. Если на каждой из 2-х параллельных чашек с
разведением 1:10 содержится меньше, чем 15 колоний, то результат выражают так:
количество микроорганизмов менее Мх10, где М - число выросших колоний.

Если количество колоний более
15, подсчитывают колонии на обеих чашках с одним и тем же разведением и
вычисляют среднюю величину, умножают ее на соответствующее разведение и
получают число микроорганизмов в 1,0 см3 
(г) продукта.

Полученный результат
округляют в соответствии с ГОСТом 26670-91 "Продукты пищевые. Методы
культивирования микроорганизмов":

- до числа, кратного 5, если
среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

- до числа, кратного 20, если
среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

- до числа, кратного 10, если
среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой
5.

Среднее арифметические от
подсчитанного количества колоний, выросших на чашках, является общим
количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1
г (см3) исследуемого продукта.

Ответ выражают и виде числа
КОЕ/г с указанием соответствия или несоответствия продукта микробиологическому
нормативу на этот показатель.

Пример: посеяно разведение
1:10; чашка 1 - 185 колоний, чашка 2 - 203 колонии;

расчет:

185+203=388:2=194 - округляем
до 200;

результат 200х
10=2000=2,0х10(3) КОЕ/г (см3).

 

7.2.
Определение бактерий группы кишечных палочек

(колиформных
бактерий)

 

7.2.1.
Сущность метода

 

В соответствии с принятой
международной номенклатурой в настоящих Методических указаниях к бактериям
группы кишечных палочек (БГКП) отнесены грамотрицательные, не образующие спор
палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре
(37±1)°С в течение 24-48 ч, в основном являющиеся представителями родов
Esherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.e. учитываются
как цитратотрицательные, так и цитратположительные варианты БГКП).

Сухие продукты типа
"Детолакт", "Новолакт ММ", "Алеся" и др.,
предназначенные для детей с первого дня жизни и употребляемые после
восстановления при (37±1)°С и (70±1)°С, перед посевом должны подвергаться
предварительной инкубации в неселективной жидкой среде для восстановления
физиологических свойств бактерий, поврежденных в процессе технологической
обработки продукта. В качестве неселективной среды обогащения используют
фосфатный буферный раствор (п.6.1.2).

Без предварительной инкубации
исследуют сухие продукты, подвергающиеся различным способам термической
обработки перед употреблением (разведение кипяченой водой (85±1)°С и выше,
доведение до кипения, пастеризация восстановленной смеси и т.д.), биологически
активные добавки, стерилизованные, кисло-молочные (сухие и жидкие) и
пастообразные продукты детского питания, а также составляющие их компоненты.

 

7.2.2.
Подготовка к анализу

 

Посуду, материалы и реактивы
подготавливают как указано в п.5.3.

 

7.2.3.
Приготовление разведений

 

Подготовку проб и
приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2.

 

7.2.4.
Посев с предварительной инкубацией детских

сухих
молочных продуктов

 

Асептически взвешивают 1 г
сухого продукта, вносят в колбочку или пробирку с 9,0 см3  разбавленного фосфатного буфера для
предварительного обогащения. Взвесь тщательно перемешивают, проверяют значение
рН при помощи индикаторной бумаги (стерильной стеклянной палочкой наносят каплю
испытуемой взвеси на полоску универсальной индикаторной бумаги и полученную
окраску немедленно сравнивают со шкалой). При необходимости доводят активную
кислотность до 7,0 ед рН, используя стерильные растворы 1 Н гидроокиси натрия или
1 Н соляной кислоты.

Колбочки помещают в термостат
при температуре (37±1)°C и выдерживают 24 часа. На следующий день засевают 1,0
см3  проинкубированной в
буферном растворе взвеси продукта в пробирку с 10,0 см3  среды Кесслер с лактозой и проводят
анализ в соответствии с п.7.2.5.

 

7.2.5.
Прямой посев

 

Для посева используют то
количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (колиформных
бактерий) соответствующими пунктами таблиц 1-9. Посев производится в среду
Кесслер с лактозой (с поплавками), с соблюдением соотношения продукта и среды
1:10. Применение среды Кода не допускается.

В производственных
лабораториях возможно производить посев сухих продуктов из первого разведения в
объеме 10,0 см3  (при
необходимости засева 1 г).

Прямые посевы продуктов или
посевы после преинкубации помещают в термостат при температуре (37±1)°С на
(24±1) ч. При отсутствии признаков роста - газообразования или помутнения
среды, дают заключение об отсутствии БГКП (колиформных бактерий) и соответствии
исследуемого продукта нормативу на БГКП (колиформные бактерии). При наличии
признаков роста - газообразования, помутнения среды Кесслер с лактозой, для
окончательного заключения о наличии в продукте БГКП (колиформных бактерий), из
подозрительных колб или пробирок производят высев на чашки со средой Эндо или
Левина (п.6.2.2.3). Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы
получить рост изолированных колоний - на отдельный сектор, лучше - на отдельную
чашку. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре (37±1)°С от 18 до
24 ч.

Учет результатов.

При отсутствии на среде Эндо
или Левина колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек (колиформных
бактерий) (на среде Эндо - красных с металлическим блеском или без него,
розовых и бледно-розовых; на среде Левина - черных с металлическим блеском,
темных с черным центром, сиреневых с темным центром) засеянная навеска продукта
считается незагрязненной ими, т.е. исследуемый продукт соответствует нормативу
на БГКП (колиформные бактерии).

При наличии на среде Эндо или
Левина типичных или подозрительных для кишечных палочек (колиформных бактерий)
колоний - их продолжают изучать. Из изолированных колоний, характерных или
подозрительных на БГКП, делают препараты, окрашивают их по Граму и
микроскопируют.

Обнаружение грамотрицательных
не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в
анализируемой массе продукта и несоответствие продукта микробиологическому
нормативу.

Примечание.

Обнаружение на среде Эндо
колоний с желтым или желто-коричневым оттенком при анализе сухих молочных каш,
содержащих в качестве компонента муку рисовую и гречневую, толокно овсяное,
крупу манную, указывает на возможную принадлежность выделенных бактерий к роду
Erwinia.

Бактерии рода Enwinia -
грамотрицательные, необразующие спор палочки, способные утилизировать лактозу с
образованием кислоты и газа, по комплексу других биохимических признаков
отличающиеся от бактерий группы кишечных палочек. Бактерии рода Enwinia
являются типичными представителями эпифитной микрофлоры зерновых культур и не
обладают патогенностью для человека и животных. Для определения принадлежности
к роду Erwinia выросших на среде Эндо нетипичных для БГКП колоний последние
пересевают на питательный агар с 5% сахарозы (п.6.2.2.17), на котором они дают
выраженный мукоидный рост, не свойственный бактериям группы кишечных палочек.
При подтверждении принадлежности подозрительных колоний роду Erwinia и
отсутствии других микроорганизмов, типичных для БГКП, исследуемый продукт
считается соответствующим нормативу на БГКП (колиформные бактерии).

 

7.3.
Определение Е. coli

 

Е. coli - не утилизирующие
цитрат грамотрицательные бесспоровые палочки, входящие в группу колиформных
бактерий и являющиеся индикатором относительно свежего фекального загрязнения,
способные расти и ферментировать лактозу при температурах выше температуры тела
человека и теплокровных животных (от 44,0 до 45,5°С).

 

7.3.1.
Сущность метода

 

Метод основан на способности
Е. coli ферментировать лактозу с образованием кислоты и газа при температуре
44,0°С от 24 до 48 часов. Идентификацию Е. coli проводят по признакам:
образование индола, положительная реакция с метиловым красным, отрицательная
реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) и отсутствие
способности утилизировать цитраты.

 

7.3.2.
Аппаратура, материалы и реактивы

 

При проведении анализов
используют аппаратуру, материалы и реактивы, перечисленные в п.4.

 

7.3.3.
Подготовка к анализу

 

Подготовку проб и
приготовление разведений осуществляют как указано в п.5.1 и 5.2.

Посуду и материалы
стерилизуют как указано в п.5.3.

 

7.3.4.
Проведение анализа с предварительной инкубацией

 

7.3.4.1. Асептически
взвешивают 10 г сухого продукта типа "Детолакт" (табл.1), растворяют
в колбе 90,0 см3  разбавленного
фосфатного буфера.

Для доведения активной
кислотности до 7,0 ед рН используют простерилизованный 1 Н раствор гидроокиси
натрия или 1 Н раствор соляной кислоты, проверяя рН индикаторной бумагой.

Колбу помещают в термостат и
выдерживают при температуре (37±1)°С в течение (24±1) ч.

7.3.4.2. На следующий день
засевают из этих колб 1,0 см3  в
пробирку или колбу с 9,0 см3  среды
Кесслер с лактозой (п.п. 6.2.2.1, 6.2.2.2) (с поплавками), помещают в термостат
и выдерживают при температуре (44±1)°С в течение (24±1) ч. При отсутствии газа,
помутнения, изменения цвета среды в посевах продуктов, подвергшихся
предварительной инкубации, результат анализа считают отрицательным и дают
заключение об отсутствии Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю,

 

7.3.5.
Проведение анализа без предварительной инкубации

 

7.3.5.1. Навеску продукта 10
г (см3) помещают в колбу с 90,0 см3 
среды Кесслер с лактозой (с поплавками). Помещают в термостат при
(44±1)°С на (24±1) ч. На следующий день колбы просматривают, при отсутствии
признаков роста посевы оставляют в термостате еще на (24±1) ч.

7.3.5.2. Пробирки и колбы с
посевами просматривают на присутствие газа. При отсутствии газа и других
признаков роста (помутнения и т.д.) в посевах дают заключение об отсутствии в
продукте Е. coli и соответствии нормативу по этому показателю.

Пробирки (колбы), в которых
обнаружен газ или другие признаки роста (помутнение среды), подвергают
дальнейшим исследованиям. Из этих пробирок производят посев штрихом или
рассевом на поверхность чашки Петри с подсушенной средой Эндо или Левина так,
чтобы получить изолированные колонии. Посевы выдерживают в термостате (37±1)°С
в течение (24±1) ч.

Эшерихии на среде Эндо
образуют колонии красные с металлическим блеском или без него, розовые, на
агаре Левина - черные, темно-коричневые колонии с темным центром, с
металлическим блеском или без него. Если при окрашивании по Граму и просмотре
под микроскопом подтверждается наличие грамотрицательных бесспоровых палочек,
то все типичные колонии подвергают идентифика