молочного жира и других
жидких продуктов и компонентов отбирают стерильной пипеткой 10,0 см3  и вносят в 90,0 см3  одного из стерильных растворов,
используемых для приготовления разведений, взбалтывают в течение (4±1) мин
круговыми движениями до возможно более полного растворения. При этом пипетку
промывают до 10 раз раствором этого продукта до верхнего уровня имеющихся на
ней делений.

Получают разведение 1:10
(первое разведение).

Топленое масло или молочный
жир вносят в растворы, подогретые до температуры от 40 до 45°С.

5.2.3. Приготовленные навески
по 10 г сухих молочных продуктов детского питания, сывороточных белковых
концентратов, казецитов и других компонентов, сгущенных продуктов, сыра, творога,
творожных изделий и других пастообразных продуктов переносят в колбу с 90,0 см3  одного из стерильных растворов,
используемых для приготовления разведений, подогретых от 40 до 45°С и
взбалтывают в течение (4±1) мин круговыми движениями до возможно более полного
эмульгирования.

Получают разведение 1:10.

При другом способе разведения
к приготовленным навескам по 10 г вышеуказанных продуктов добавляют 90,0 см3  одного из стерильных растворов,
подогретых от 40 до 45°С и далее поступают как указано и п.5.2.3.

5.2.4. Для получения
однородной взвеси продукта допускается перемешивание на аппарате для
встряхивания жидкостей в течение (6±1) мин, избегая намокания пробок. Первое
разведение продукта (1:10) можно гомогенизировать в стерильном стакане
гомогенизатора или растереть в стерильной ступке.

5.2.5. Из первого разведения
продукта стерильной пипеткой берут 1,0 см3  и переносят в пробирку, содержащую 9,0 см3  стерильного раствора, используемого
для приготовления разведений, перемешивают осторожно, набирая и выдувая из
пипетки 5-10 раз. Получают второе разведение продукта (1:100). Последующие
разведения в зависимости от предполагаемого обсеменения продукта 1:1000,
1:10000 и т.д. готовят аналогично.

Для приготовления каждого
разведения берут новую стерильную пипетку. Вводят пипетку в пробирку не более,
чем на 2-3 см ниже поверхности взвеси.

Время от момента
приготовления разведений до посева не должно превышать 20-30 мин. Перед посевом
все разведения осторожно встряхивают. При посеве на чашки Петри или в пробирки
посевной материал вносят от большего разведения к меньшему. В этом случае
пользуются одной пипеткой.

5.2.6. Для приготовления
разведений сухих молочных каш для детского питания используют надосадочную
жидкость первого разведения продукта после отстаивания его в течение 2-3 мин.

 

5.3.
Подготовка посуды и материалов

 

5.3.1. Всю новую посуду,
предназначенную для бактериологических работ, кипятят в подкисленной воде
(раствор соляной кислоты с объемной долей 1-2%) в течение (15±5) мин и затем
ополаскивают дистиллированной водой.

Посуду, бывшую в
употреблении, моют 0,5%-ным щелочным раствором с помощью ершей и щеток и ополаскивают
водопроводной водой. Сильно загрязненную посуду со следами жира, красок и
иммерсионного масла опускают на 2 ч в хромовую смесь, подогретую от 40 до 45°С,
затем тщательно промывают проточной водопроводной водой.

Посуда с питательными
средами, после подсчета на них дрожжей, плесневых грибов, бактерий группы
кишечных палочек, Е. coli, S. aureus, энтерококков, сальмонелл и других видов
условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, обеззараживается перед мойкой
путем стерилизации в автоклаве при (121±1)°С в течение (30±1) мин или
кипячением в течение 1 ч.

Вымытую посуду не вытирают, а
сушат при комнатной температуре или горячим воздухом.

Предметные стекла после мойки
и ополаскивания вытирают чистой салфеткой или помещают в склянку с притертой
пробкой в смесь этилового спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1.

5.3.2. Лабораторную посуду
перед использованием обязательно стерилизуют. Стерилизацию осуществляют сухим
жаром в сушильном шкафу при (160±5)°С в течение 2 ч или паром в автоклаве при 1
атм (121±1)°С в течение (30±1) мин с последующим подсушиванием в сушильном
шкафу.

Перевод давления,
показываемого манометром автоклава, в температуру проводится следующим образом:

- 0,5 атм - 112°С;

- 0,7 атм - 116°С;

- 0,8 атм - 118°С;

- 1,0 атм - 121°С;

- 2,0 атм - 134°С

Чашки Петри, пипетки и т.п.
стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю
часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Пробирки, флаконы, бутылки,
колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок)
надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или
закрепляют резиновым колечком.

Каучуковые, корковые и
стеклянные пробки стерилизуют отдельно в автоклаве завернутыми в бумагу.

Стерильную посуду хранят в
плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной
посуды - не более 30 суток при ненарушенной завертке или невскрытых пеналах.

 

6.
Приготовление питательных сред и реактивов

 

6.1
Питательные среды и реактивы общего назначения

 

6.1.1. Концентрированный
фосфатный буферный раствор

 

Взвешивают 34 г
однозамещенного фосфорнокислого калия и растворяют в 500,0 см3  дистиллированной воды в мерной колбе,
вместимостью 1000 см3. Устанавливают активную кислотность раствора (7,2±0,1) ед
рН 1н раствором гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до 1000,0
см3. Хранят в емкости, укупоренной резиновой пробкой, в условиях холодильника
не более 30 суток.

 

6.1.2.
Разбавленный фосфатный буферный раствор

 

Вносят пипеткой, вместимостью
2 см3, 1,25 см3  концентрированного
фосфатного буферного раствора в мерную колбу, вместимостью 1000 см3, и доводят
объем дистиллированной водой до метки, проверяют активную кислотность (7,1±0,1)
ед рН.

Разливают разбавленный
фосфатный буферный раствор по 10,0 см3 
в пробирки, по 100,0 см3 
в колбы, вместимостью 200 см3, и по 900,0 см3  в колбы, вместимостью 1600 см3,
закрывают ватными пробками. Стерилизуют в автоклаве при (121±1)°С в течение
(20±1) мин.

 

6.1.3.
0,1%-ный водный раствор пептона (пептонная вода)

 

К 1,0 дм3  дистиллированной воды добавляют 1 г
пептона. После размешивания среду кипятят, фильтруют и разливают в пробирки и
флаконы в необходимых количествах. Стерилизуют при (121±1)°С в течение (30±1)
мин.

 

6.1.4.
Изотонический 0,85%-ный раствор хлористого натрия

 

Для приготовления
изотонического раствора, активной кислотностью (7,0±0,1) ед рН, используют
дистиллированную воду, рН которой проверяют индикатором бромтимолблау. При его
добавлении цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных случаях воду не
используют.

В 1,0 дм3  воды растворяют 8,5 г хлористого
натрия, разливают раствор в чистые пробирки, диаметром 18-20 мм, по 10,0 см3, а
в колбы - по 93,0 см3  и
стерилизуют в течение (15±1) мин при (121±1)°С.

 

6.1.5.
Приготовление раствора лимоннокислого натрия

для
приготовления разведений сыра

 

В 1000,0 см3  дистиллированной воды растворяют 20 г
трехзамещенного лимоннокислого натрия, разливают в пробирки по 10,0 см3  и колбы по 93,0 см3  и стерилизуют при (121±1)°С в течение
(20±1) мин.

 

6.1.6.
Стерильная дистиллированная вода

 

Дистиллированную воду
разливают в колбы или пробирки в необходимых количествах и стерилизуют в
течение (20±1) мин при (121±1)°С.

 

6.1.7.
Раствор двууглекислого натрия для нейтрализации проб

кисло-молочных
продуктов и закваски

 

10 г двууглекислого натрия
помещают в мерную колбу, вместимостью 100 см3, растворяют дистиллированной
водой, доводят объем раствора до метки. Раствор разливают в пробирки и
стерилизуют при (121±1)°С в течение (30±1) мин.

 

6.1.8.
Реактивы для окраски по Граму (модификация Г.П.Калины)

 

Реактив
1.

К 100,0 см3  этилового спирта добавляют 0,5 г
кристаллического фиолетового.

Реактив
2.

К 96,0 см3  0,5%-ного спиртового раствора
йодистого калия добавляют 2,0 см3  5%-ного
спиртового раствора основного фуксина и 2,0 см3  5%-ного спиртового раствора йода.

Примечание. Растворение йодистого калия в спирте
рекомендуется проводить в водяной бане при температуре от 45 до 50°С при
постоянном помешивании.

 

6.1.9.
Приготовление реактивов из метиленового голубого

 

Приготовление
основного спиртового раствора метиленового голубого.

10 г метиленового голубого
смешивают со 100,0 см3  96%-ного
этилового спирта. Раствор ставят в термостат при температуре (37±1)°С на (24±1)
ч, а затем фильтруют в термостате при той же температуре. Срок хранения
основного раствора метиленового голубого в термостате при температуре (37±1)°С
не более 3-х месяцев при условии герметичной укупорки.

Приготовление
рабочего раствора метиленового голубого.

Основной раствор помещают в
водяную баню при температуре (45±1)°С на (8±2) мин, перемешивают до полного
растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры (20±1)°С и 5,0 см3  этого раствора прибавляют к 195,0 см3  дистиллированной кипяченой воды. Смесь
хорошо перемешивают. Срок хранения рабочего раствора метиленового голубого - не
более 7 суток при температуре от 8 до 10°С.

Приготовление раствора
метиленового голубого для окраски препаратов.

К 30,0 см3  основного спиртового раствора
метиленового голубого прибавляют 100,0 см3  дистиллированной воды и 1,0 см3  раствора гидроокиси калия с массовой
концентрацией 10 г/дм3.

 

6.1.10.
Приготовление карболового раствора кристаллического

фиолетового
для окраски препаратов

 

1 г красителя
кристаллического фиолетового растирают в ступке с 2 г кристаллической
карболовой кислоты до кашицы, прибавляют небольшими порциями 10,0 см3  96%-ного этилового спирта. Доводят
объем до 100 см3  дистиллированной
водой. Таким образом получают основной раствор для приготовления рабочего
раствора.

К 10,0 см3  основного карболового раствора
кристаллического фиолетового добавляют 90,0 см3  дистиллированной воды. Тщательно перемешивают.

Растворы хранят в темном
флаконе под притертой пробкой.

 

6.1.11.
Мясо-пептонный бульон

 

Говяжье мясо, освобожденное
от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, взвешивают, складывают в
кастрюлю, смешивают с двойным количеством водопроводной воды и оставляют на
(18±6) ч при температуре (5±1)°С. Для ускорения процесса выделения питательных
веществ из мяса содержимое кастрюли подогревают при температуре (50±5)°С в
течение (1±0,1) ч и затем кипятят (35±5) мин. После кипячения бульон в горячем
состоянии фильтруют через двойной бумажный фильтр. Фильтрат доводят питьевой
водой до первоначального объема, добавляют к нему (1,0±0,1)%-ного пептона и (0,5±0,1)%-ного
хлористого натрия. Устанавливают с помощью 1 н раствора гидроокиси натрия
активную кислотность (7,3±0,1) ед рН. Приготовленный бульон разливают в колбы и
стерилизуют при (121±1)°С в течение (20±1) мин.

 

6.1.12.
Мясо-пептонный агар

 

К 1,0 дм3  мясо-пептонного бульона или перевара
Хоттингера, с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/л добавляют 15 г
мелко нарезанного агара в волокнах или порошке. После 10-15-минутного набухания
агар-агара смесь кипятят при постоянном помешивании до полного его растворения.
Полученную среду после установления активной кислотности (7,3±0,1) ед рН
фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и
пробирки и стерилизуют при (121±1)°С в течение 20 мин.

 

6.2.
Специальные питательные среды и реактивы

 

6.2.1.
Среды для определения общего количества мезофильных аэробных

и
факультативно-анаэробных микроорганизмов

 

6.2.1.1. Среда для
определения аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.