|

|вар.L2       | 
1  | + | + | + | +  | + 
| +  | +   | +  
| +   | -    |

|—————————————|—————|———|———|———|————|————|————|—————|—————|—————|——————|

|B.mycoides   |    
|   |   |   |    |   
|    |     |     |     |     
|

|537          | 
1  | + | + | + | +  | + 
| +  | +   | -  
| -   | -    |

|—————————————|—————|———|———|———|————|————|————|—————|—————|—————|——————|

|Micrococcus  |    
|   |   |   |    |   
|    |     |     |     |     
|

|luteum ATCC  |    
|   |   |   |    |   
|    |     |     |     |     
|

|9341         | 
1  | + | + | + | +  | + 
| +  | -   | -  
| -   | -    |

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


Обозначения: знак плюс (+) -
полное обесцвечивание метиленового синего, знак минус (-) - отсутствие
обесцвечивания.

Максимальное разведение
тест-культур, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего и выявленное
через 1 ч инкубации в термостате при 37° С, принимают за "рабочую
дозу".

В среднем, "рабочая
доза" тест-культур определяется у:

     Вас.subtilis, вар.6633                            в разведении 1:256

     Вас.subtilis, вар.L2                              в разведении
1:512

     Вас.mycoides 537                                  в разведении
1:128

     Micrococcus luteum AТCC 9341                      в разведении 1:64

 

Титрование стандарта
антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме
0,5 мл мясо-пептонного бульона. Последняя пробирка в контрольном ряду не
содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности клеток
тест-культуры.

После этого во все пробирки
вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры,
т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее обесцвечивание
метиленового синего через 1 ч. В результате микробная нагрузка в пробирках
уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.

Пробирки встряхивают и
помещают в термостат при температуре (37+-1) °С на 3-часовую экспозицию
тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного
мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь
смешивают и инкубируют при температуре (37+-1) °С в термостате.

Если в исследуемом объекте
содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных
клеток тест-культур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не
обесцвечивается (-синий).

О степени активности
антибиотика судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное
подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 ч инкубации в
термостате при температуре (37+-1) °С по сравнению с контролем.

 

3.4.1.
Определение концентрации бензилпенициллина, стрептомицина и

тетрациклина.

 

Приготовление
стандарта бензилпенициллина

Во флакон, содержащий 500000
ЕД натриевой соли бензилпенициллина товарного препарата для инъекций, добавляют
10 мл 0,066 М фосфатного буфера pH 7,0. Концентрация исходного раствора
пенициллина составляет 50000 ЕД/мл. Далее получают 5000 ЕД/мл, разводя этот
раствор в 10 раз. К 1 мл этого раствора прибавляют 4 мл 0,066 М фосфатного
буфера, pH 7,0. Получают основной раствор пенициллина - 1000 ЕД/мл. Затем разводят
десятикратно 0,066 М фосфатным буфером, pH 7,0 до 100 и 10 ЕД/мл. После этого
0,5 мл последнего разведения, т.е. 5 ЕД/мл добавляют в 1-ю пробирку с заранее
разлитым по 0,5 мл мясо-пептонным бульоном. Получают разведение пенициллина в
1-й пробирке - 2,5 ЕД/мл. Далее делают двукратные разведения антибиотика в 0,5
мл мясо-пептонного бульона. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси, содержащей
двойную "рабочую дозу" тест-культуры. В результате микробная нагрузка
во всех пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе"
тест-культуры, при этом концентрация пенициллина в 1-й пробирке уменьшается еще
в 2 раза и соответствует 1,25 ЕД/мл. Таким образом, получают разведения
пенициллина:

     в 
1-й  пробирке 1,25 ЕД                    в 6-й пробирке 0,035 ЕД

     во 2-й 
пробирке 0,62 ЕД                   
в 7-й пробирке 0,017 ЕД

     в 
3-й  пробирке 0,31 ЕД                    в 8-й пробирке 0,008 ЕД

     в 
4-й  пробирке 0,15 ЕД                    в 9-й пробирке 0,004 ЕД.

     в 
5-й  пробирке 0,07 ЕД

Последняя 10-я пробирка не
содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности тест-культуры
(табл.2).

 

Приготовление
стандарта стрептомицина

Во флакон, содержащий 500000
ЕД стрептомицина сульфата товарного препарата для инъекций, добавляют 10 мл
0,066 М фосфатного буфера, pH 6,0-6,2. Концентрация исходного раствора
стрептомицина составляет 50000 ЕД/мл. Далее исходный раствор разводят в 10 раз
0,066 М фосфатным буфером, pH 7,8-8,0. Получают раствор 5000 ЕД/мл.

Последующие разведения
готовят на 0,066 М фосфатном буфере, pH 7,8-8,0, аналогично вышеописанной схеме
к бензилпенициллину.

 

Приготовление
стандарта тетрациклина

Для приготовления исходных
растворов антибиотиков могут быть использованы лекарственные препараты
антибиотиков или стандарты препаратов с известной активностью. В первичном
растворе каждого антибиотика учитывают его активность в 1 мг (при использовании
стандарта препарата) или содержание активного вещества в лекарственной форме
(например, 100000 ЕД во флаконе). Основную концентрацию 1000 ЕД/мл или 1000
мкг/мл готовят, разводя препарат во флаконе, содержащем 100000 ЕД тетрациклина,
в 100 раз.

 

 

 

Таблица 2

 

Концентрация
стандарта бензилпенициллина

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


|    Время  
  |Учет интенсивности клеточного
дыхания             |Конт-|

|обесцвечивания|                                                 
|роль |

| метиленового
|Разведение антибиотика в ЕД/мл                    |тест-|

|  синего, ч  
|                                                  |куль-|

|              |                                                  |туры |

|——————————————|——————————————————————————————————————————————————|—————|

|             
|1,25|0,62|0,31|0,15|0,07|0,035|0,015|0,007|0,0035 | К   |

|——————————————|————|————|————|————|————|—————|—————|—————|———————|—————|

|      1      
|  - | -  | - 
| -  | +- | +   | +  
| +   | +     | +  
|

|——————————————|————|————|————|————|————|—————|—————|—————|———————|—————|

|      2      
|  - | -  | - 
| -  | -  | +  
| +   | +   | +    
| +   |

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


Обозначения: (+) - полное
обесцвечивание метиленового синего, (+-) - частичное обесцвечивание
метиленового синего, (-) - отсутствие обесцвечивания.

При активности стандарта
тетрациклина 850 мкг/мл в 10 мг навески содержится 8500 мкг антибиотика.

Для получения первого
разведения основного раствора стандарта антибиотика в 1000 мкг устанавливают
необходимый объем растворителя: 850х10=8500:1000=8,5 мл. Таким образом, навеску
тетрациклина 10 мг растворяют в 8,5 мл 0,01 Н HCI и получают концентрацию
основного раствора 1000 мкг/мл. Приготовленный основной раствор может храниться
в холодильнике в течение 7 дней.

Далее основной раствор 1000
мкг/мл разводят десятикратно цитратно-солянокислым буфером, pH 6,0-6,2, до 100
и 10 мкг/мл. Все последующие разведения, готовят также на цитратно-солянокислом
буфере, pH 6,0-6,2, и проводят расчеты активности стандарта тетрациклина аналогично
схеме расчета по пенициллину и стрептомицину.

 

3.5.
Определение концентрации антибиотиков в испытуемом растворе

 

Параллельно ставят второй ряд
с двукратными разведениями испытуемого субстрата в пробирках с заранее разлитым
мясо-пептонным бульоном в объеме 0,5 мл. Во все пробирки этого ряда также
вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры
(т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее полное обесцвечивание
метиленового синего через 1 ч инкубации в термостате). В результате микробная
нагрузка уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе"
тест-культуры.

Таким образом, 1-я пробирка
каждого ряда, контрольного и испытуемого, начинается с разведения 1:4.

Последняя пробирка не
содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности
тест-культуры.

Пробирки встряхивают и
помещают в термостат на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком.
Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку добавляют
по 2 мл 1%-ного мясо-пептонного агара с метиленовым синим и глюкозой.
Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют в термостате при температуре
(37+-1) °С.

Учет результатов производят
по тесту подавления антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культуры через
1 или 2 ч инкубации в термостате (табл.3).

Концентрацию антибиотика в
исследуемом субстрате с неизвестным его количеством вычисляют путем умножения
последнего разведения субстрата, подавляющего дегидрогеназную активность
тест-культуры (табл.3), на минимальную концентрацию антибиотика контрольного
ряда стандарта, вызывающего тот же эффект (табл.2).

Как видно из табл.2,
последнее разведение стандарта бензилпенициллина вызывает полное подавление
активности дыхательных ферментов тест-культуры, по сравнению с контролем,
только через 2 ч инкубации в термостате и составляет 0,07 ЕД/мл. Через 1 ч
инкубации антибиотик вызывает лишь частичное подавление дегидрогеназной
активности клеток.

Таким образом, концентрация
пенициллина, вызывающая полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культуры, соответствует
0,07 ЕД/мл через 2 ч инкубации в термостате при температуре (37+-1) °С.

Пример

Таблица 3

 

Концентрация
бензилпенициллина в испытуемом субстрате

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


|Время |          Учет интенсивности клеточного
дыхания           |Конт-|

|обес-
|——————————————————————————————————————————————————————————|роль |

|цвечи-|                                                          |тест-|

|вания |       Разведения испытуемого субстрата или
образца       |куль-|

|мети- |                                                          |туры |

|лено- |                                                          |     |

|вого  |                                                          |     |

|сине-
|——————————————————————————————————————————————————————————|—————|

|го, ч |1:4 |1:8 |1:16
|1:32  |1:64 |1:128  |1:256 |1:512|1:1024  |  К  |

|——————|————|————|—————|——————|—————|———————|——————|—————|————————|—————|

| 1    | - 
| +- | +   | +    | +  
| +     | +    | +  
| +      |  +  |

|——————|————|————|—————|——————|—————|———————|——————|—————|————————|—————|

| 2    | - 
| -  | +   | +   
| +   | +     | +   
| +   | +      | 
+  |

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


Учесть результат в данном
опыте возможно только через 2 ч инкубации по полному подавлению дегидрогеназной
активности клеток тест-культуры, которое наблюдается в разведении 1:8, так как
через 1 ч инкубации испытуемый субстрат вызывает лишь частичное подавление
активности дыхательных ферментов тест-культуры по сравнению с контролем
(табл.3).

Содержание пенициллина в
исследуемом субстрате вычисляют, умножив последнее разведение субстрата,