Методические
указания МУК 4.2.026-95

"Экспресс-метод
определения антибиотиков в пищевых продуктах"

(утв.
Председателем Госкомсанэпиднадзора РФ -

Главным
государственным санитарным врачом РФ 29 марта 1995 г.)

 

1. Область
применения

 

Методические указания
предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического
надзора и других организаций, осуществляющих контроль за качеством продуктов
питания.

 

2. Сущность
метода

 

Методические указания
содержат описание ускоренного метода качественного и количественного
обнаружения антибиотиков в пищевых продуктах и других субстратах, основанного
на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой
питательной среде.(1)

Дегидрогеназы-ферменты
активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к
нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки.

Высокая чувствительность этих
ферментов к неблагоприятным воздействиям использована для выявления
повреждающего действия антибиотика на различные тест-культуры. В методе
используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий
в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие,
клетки тест-культур лишаются такой возможности и метиленовый синий не
восстанавливается. Метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль
акцептора водорода и индикатора, позволяющего судить о повреждающем действии
антибиотиков на клеточные дегидрогеназы за определенный отрезок времени.

Данные сравнительного
изучения экспресс-метода с общепринятым (диффузии в агар) свидетельствуют о
высокой степени корреляции (коэффициент Р=0,84-0,93 и значим с вероятностью
99,9%).

Преимущество экспресс-метода
заключается в возможности получения ответа через 4-5 ч, относительной простоте
и значительной экономии питательной среды.

Методика может быть
осуществлена как в качественном, так и в количественном варианте, при этом при
подсчете концентрации выявленного загрязнения использован титрационный принцип,
в определенной степени облегчающий постановку анализа в баклабораториях и
позволяющий получить достоверные результаты без построения стандартной кривой
или расчета по таблицам активности антибиотиков.

Лабораторный контроль,
позволяющий выявить непосредственные источники загрязнения, принимать меры,
снижающие контаминацию продуктов и, соответственно, риск для потребителей,
целесообразно, главным образом, осуществлять в первичном звене получения
животноводческой продукции: на молочно-товарных фермах, птицефабриках, в
убойных и мясо-перерабатывающих цехах хозяйств и т.п., сельскохозяйственных
предприятиях, получающих и перерабатывающих продовольственное сырье животного
происхождения. Готовая животноводческая продукция также должна контролироваться
путем периодического отбора на молочных заводах, мясокомбинатах,
птицеперерабатывающих заводах и т.п.

Допустимое содержание
антибиотиков в продуктах не должно превышать для тетрациклинов 0,01 ЕД, пенициллина
0,01 ЕД, для стрептомицина 0,5 ЕД на 1 г (мл) продукта.(2)

Метод состоит из нескольких
этапов:

1. Подготовка проб к
исследованию при качественном и количественном определении

2. Получение и хранение
взвеси клеток тест-культур

3. Определение "рабочей
дозы" тест-культур

4. Определение концентрации
антибиотиков и расчет активности

5. Определение концентрации
антибиотиков в испытуемом растворе

6. Качественное определение
антибиотиков

 

3. Этапы
исследования

 

3.1.
Подготовка проб к исследованию при качественном и

количественном
определении

 

3.1.1.
Подготовка проб к исследованию при качественном определении.

 

Молоко и
сливки жидкие (в сыром или пастеризованном виде)

Сырое молоко желательно
подвергать исследованию в день отбора, как можно быстрее после получения (отбор
на фермах); до начала анализа сохранять в холодильнике при температуре (4+-1)
°С. Пробу в объеме не менее 10 см3 переносят в пробирку.

 

Сухие
молочные продукты (сухое молоко, сухие сливки, сухие детские

молочные
продукты, изготовленные на основе коровьего молока)

Непосредственно перед
исследованием продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при
температуре не выше (45+-1) °С в соответствии с указаниями на этикетке. Образцы
тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или
комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа в объеме не
менее 10 см3.

 

Яйца,
меланж

Яйца, предназначенные для
исследования, предварительно прогревают на водяной бане при температуре (65+-1)
°С в течение 10-15 мин до коагуляции белка, затем полностью смешивают
содержимое яйца, от которого отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10
см3.

 

Мясо и
субпродукты

Мясо и субпродукты (печень,
почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают
при помощи мясорубки или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри
и дают стечь тканевому соку. Тканевой сок в объеме не менее 10 см3 переносят в
пробирку.

 

Термическая
обработка проб пищевых продуктов

Перед проведением
исследования пробирки с отобранными пробами (см. п.3.1.1) помещают в водяную
баню с температурой (60+-1) °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную
баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания
- 30 мин - отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки.

 

3.1.2.
Подготовка проб к исследованию при количественном

определении.

 

Молоко,
молочные продукты и яйца

Для определения концентрации
антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, яйцах,
пробы, подготовленные к исследованию (см. п.3.1.1) в количестве 10 мл или 10 г
(смешанного содержимого каждого яйца) вносят в колбы емкостью 50 мл и добавляют
равное количество (10 мл) буферного раствора соответственно определяемому
антибиотику: при определении тетрациклина - цитратно-солянокислый буфер N 2;
стрептомицина или пенициллина - фосфатный буфер N 4 и N 1 соответственно. Таким
образом, получают пробы для исследования, разведенные в 2 раза.

 

Мясо и
мясные продукты

Навески по 10 г мышечной
ткани, почки, печени, легкого и т.д., вырезанные из средней части образца,
измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в
ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10 мл
соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные
пробирки. Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 мин в термостате при
температуре (37+-1) °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при температуре
(65+-1) °С 30 мин и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Из
надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1:2, берут 1 мл и
прибавляют 1 мл соответствующего буфера, получают второе разведение 1:4 и т.д.
Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от
каждого образца мяса и мясных продуктов.

 

3.2.
Получение и хранение взвеси клеток тест-культур

 

Тест-культурами служат
вегетативные формы спорообразующих и неспорообразующих культур: Вас.subtilis,
вар. 6633; Вас.subtilis, вар.L2; Вас.mycoides 537; Micrococcus luteum ATCC
9341, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.

Для определения пенициллина и
стрептомицина предпочтительно пользоваться спорообразующими тест-культурами:

Вас.subtilis, вар.6633;
Вас.mycoides 537 u Micrococcus luteum ATCC 9341;

для тетрациклина -
Вас.subtilis, вар.L2.

Музейные штаммы вегетативных
форм тест-культур хранят в столбике полужидкого (0,4%) питательного агара.

Вначале тест-культуру
рассевают на чашки с 2%-ным мясо-пептонным агаром для получения отдельных
колоний. Чашки ставят в термостат при температуре (37+-1) °С на 20+-3 ч. После
чего мелкие колонии отсевают в пробирки с 2%-ным мясо-пептонным скошенным агаром
и вновь инкубируют в термостате при температуре (37+-1) °С в течение 20+-3 ч.

Микробную взвесь готовят
путем смыва физиологическим раствором суточной культуры со скошенного агара.
Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную
взвесь хранят в холодильнике при температуре (4+-1) °С не более 7 дней.

 

3.3.
Определение "рабочей дозы" тест-культур

 

Поскольку количество
жизнеспособных клеток тест-культуры от смыва к смыву варьирует, предварительно
необходимо определить "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. наибольшее
разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в
определенное время в термостате при температуре (37+-1) °С. Следует учитывать,
что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству
клеток в смыве.

Для постановки реакции
выбрано время обесцвечивания, равное 1 ч. Это время, будучи величиной
постоянной, выявляет в суспензиях различной плотности одну и ту же клеточную
нагрузку для каждой тест-культуры в отдельности. "Рабочую дозу"
тест-культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.

 

3.3.1.
Методика определения "рабочей дозы" тест-культуры.

 

Полученную взвесь
тест-культур титруют путем последовательных двукратных разведений в объеме 1 мл
питательного бульона. Пробирки с тест-культурой встряхивают и помещают в
термостат при температуре (37+-1) °С на 3 ч. Затем для создания условий,
близких к анаэробным, в каждую пробирку вносят по 2 мл растопленного и
охлажденного до температуры (45+-1) °С 1%-ного питательного агара с метиленовым
синим и глюкозой (оба ингредиента асептично вносят в растопленный 1%-ный
питательный агар из расчета: на 100 мл среды 0,4 мл 0,5%-ного водного раствора
метиленового синего и 1 мл 40%-ного раствора глюкозы). Пробирки встряхивают и
вновь инкубируют в термостате при температуре (37+-1) °С в течение 1-2 ч, после
чего учитывают результат (табл.1). Дыхательные ферменты бактериальных клеток
тест-культур восстанавливают метиленовый синий в анаэробных условиях, и
содержимое пробирок, имеющее синий цвет, обесцвечивается. Разведение
тест-культуры в последней пробирке с обесцвеченным метиленовым синим (+)
принимают за "рабочую дозу". Функциональная активность дегидрогеназ
тест-культур стабилизируется через сутки после получения смыва, который
хранится в холодильнике в течение 1 недели. Поэтому "рабочую дозу"
первый раз определяют через сутки, а затем - через 3 дня.

 

3.4.
Количественное определение концентрации антибиотиков и расчет

активности

 

При определении концентрации
антибиотика в пищевых продуктах параллельно ставят контрольный ряд с известным
содержанием антибиотика в пробирках. Для этого навеску стандарта антибиотика (1
мг) растворяют в 1 мл соответствующего буфера, получая, таким образом, основной
раствор стандарта 1000 мкг/мл. Затем основной раствор десятикратно разводят до
получения 100 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее концентрации, с которых начинается
титрование стандарта в контрольном ряду (2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл и т.д.), разводят
соответствующими буферными растворами.

 

Таблица 1

 

Определение
"рабочей дозы" тест-культур

 ———————————————————————————————————————————————————————————————————————


|Тест-культуры|Время|     Учет интенсивности клеточного
дыхания         |

|             |  ч  |———————————————————————————————————————————————————|

|             |     |            
Разведения тест-культур              
|

|             |     |———————————————————————————————————————————————————|

|             |     |1:2|1:4|1:8|1:16|1:32|1:64|1:128|1:256|1:512|1:1024|

|—————————————|—————|———|———|———|————|————|————|—————|—————|—————|——————|

|B.subt.,     |    
|   |   |   |    |   
|    |     |     |     |     
|

|вар.6633     | 
1  | + | + | + | +  | + 
| +  | +   | +  
| -   | -    |

|—————————————|—————|———|———|———|————|————|————|—————|—————|—————|——————|

|B.subt.,     |    
|   |   |   |    |   
|    |     |     |     |